星点及正交实验法优选穿龙薯蓣总皂苷的提取工艺

陈惠雪

（武汉市中医医院，湖北武汉430010）

穿龙薯蓣为薯蓣科薯蓣属多年生草质藤本植物，主产于黑龙江、吉林和辽宁省东部山区。穿龙薯蓣以根茎入药，穿山龙性温，味甘、苦，具有舒筋活血、止咳化痰、祛风止痛等作用［1］。现代研究证实其具有良好的抗肿瘤、降血脂等作用［2-5］。

近年来穿龙薯蓣已经作为合成甾体激素药物和抗冠心病皂苷类药物的重要工业原料［6］，穿龙薯蓣的有效成分主要为甾体皂苷类，包括薯蓣皂苷（dioscin）、纤细皂苷（gracillin）和水溶性皂苷等［7］。市售产品有穿山龙注射液、地奥心血康胶囊和地奥配质等，具有很好的药用价值与开发应用前景。本实验通过两种设计方法优化穿龙薯蓣总皂苷的提取方法，确定其最优提取工艺，为工业化生产实践提供实际参考。

1 实验材料

UV2100紫外可见分光光度仪（岛津国际贸易有限公司），SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义市予华有限公司），JD60-4型电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司），薯蓣皂苷（批号：111707-201208，购自中国食品药品检定研究院，纯度≥98%），其余试剂为分析纯。材料来源于吉林省，经辽宁中医药大学药用植物教研室尹海波教授鉴定为薯蓣科植物穿龙薯蓣的根茎。

2 方法与结果

2.1 紫外测定方法的系统性研究

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取薯蓣皂苷对照品适量于10 mL量瓶中，用甲醇超声溶解，并定容至刻度线，制得浓度为0.6553 mg/mL的对照品溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 分别精密称取原药材粉末（过40目）约5.00 g，置200 mL圆底烧瓶中，按本实验设计计划分别进行提取，滤液经真空抽滤，残渣继续提取1次，合并2次滤液并浓缩定容于25 mL量瓶中，摇匀。弃去初滤液（0.45 μm滤膜），取续滤液作为供试品溶液，备用。

2.1.3 测定方法及波长的选择 精密移取供试品溶液1.0 mL置于密闭具塞试管中，挥干溶剂，再分别加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，密闭，置65℃水浴锅中显色20 min，取出后以冰水浴冷却5 min，最后再加入冰醋酸5.0 mL，摇匀，静置10 min。以空白试剂为参比溶液，用UV2100紫外-可见分光光度计于190～800 nm范围内进行全波长扫描，结果发现其最大吸收波长为457 nm。

2.1.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取对照品溶液0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，0.9 mL，1.0 mL 至 5 支具塞比色管中，按上述“2.1.3项”下测定方法，同法制备，于457 nm处测定其吸光度A值。分别以吸光度（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，并得到回归方程如下：Y=19.349X-0.0104，R2=0.9997，结果显示，穿龙薯蓣薯蓣皂苷线性在0.0437～0.1092 mg/mL范围内良好。

2.1.5 稳定性试验 同一供试品溶液，于0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h时间点分别进行测定，其吸光度值分别为 0.545、0.556、0.549、0.542、0.551、0.539，其RSD为1.14%。结果表明，供试品溶液在48 h内基本稳定。

2.1.6 精密度试验 同一薯蓣皂苷对照品稀释液，在上述方法下同法同量连续测定5次，记录吸光度值并计算其RSD值。其吸光度值分别为0.534、0.552、0.538、0.537、0.541，结果其RSD为1.29%，结果表明，仪器精密度良好。

2.1.7 加样回收率试验 称取已知含量的药材5.0 g，分别加入 4 mg、5 mg、6 mg对照品（80%、100%、120%），按照上述“2.1.2项”下制备方法，分别平行制备3份，所得加样回收率平均值分别为100.3%、98.8%、101.4%，其RSD为1.31%。

2.2 穿龙薯蓣回流提取工艺优化

2.2.1 正交试验设计 根据有关文献报道研究，实验固定提取为2次［8-9］。本实验采用回流提取法，选用乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）和提取温度（D）为4个考察因素，用L9（34）正交实验设计表安排实验，总皂苷含量作为评价指标。正交试验设计及结果见下表1。

结果分析：①宏观分析：由极差R的大小，得知各因素对总皂苷含量影响程度的大小为A>D>B>C，即乙醇浓度为最重要的影响因素，其余依次为提取温度、料液比、提取时间，最佳提取工艺为A2D2B3C2。②方差分析：经过SPSS 19.0软件分析，结果显示，乙醇浓度和提取温度对总皂苷含量有显著影响（表2）。综合宏观分析及生产实践，故确定其最佳提取工艺为20倍量75%的乙醇85℃下回流提取2 h。

表1 正交试验表

表2 方差分析结果

2.2.2 验证试验 为保证正交试验结果的可靠性和重现性，在此最佳提取条件下进行3次重复验证试验，结果总皂苷含量分别为27.24 mg/g、26.65 mg/g、26.83 mg/g，平均含量为 26.91 mg/g。

2.2.3 星点实验设计 结合前期单因素与预实验结果，本试验固定提取温度为85℃，固定提取2次，选取乙醇浓度（A）、料液比（B）和提取时间（C）作为考察因素。根据星点设计的原理，每因素设5个水平，用代码值-α、-1、0、1、α 来表示（α=1.732）。实验安排与结果见表3。

2.2.3.1 二次回归拟合及方差分析 本实验应用Design Expert 8.0软件，以总皂苷含量（R1）为因变量，对各因素进行多元线性回归和二项式拟合。并由软件分析的回归系数拟合其回归方程（编码值）。R1=26.35+1.68A+0.71B+1.64C-0.39×AB-0.98AC+0.41BC-1.88A2-1.47B2-1.24C2。

从模型及系数方差分析可知，本实验模型具有统计学意义（P＜0.05），失拟（P＞0.05）不显著，说明本实验模型拟合程度良好，实验误差小，可以使用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析评价（表4）。本模型响应面分析图，见图1～图3。

2.2.3.2 最佳工艺条件的预测与检验结果 通过对本实验模型的预测，得到穿龙薯蓣总皂苷含量的最佳提取工艺条件为乙醇浓度77.25%，料液比15.84，提取时间130.49 min，预测响应值为27.17 mg/g。为保证实验结果的可靠性和重现性，采用此最佳条件下进行3次验证实验，考虑到实际操作的简便，综合选取乙醇浓度为77%，料液比为16，提取时间为130 min，结果响应值为27.08 mg/g，与理论值的误差为0.09 mg/g，符合实际生产实践要求。

表3 星点试验设计与结果 （mg/g）

表4 模型及系数方差分析

3 讨论

星点设计法已在国内进行多方面应用，而传统的正交设计优势仍然存在，原因在于实验次数少，实验信息丰富，可知晓试验因素对因变量影响的程度大小［10］。正交实验最佳提取工艺为20倍量75%的乙醇85℃下回流提取2 h，而星点实验设计最佳提取工艺为：乙醇浓度77.25%，料液比15.84，提取时间130.49 min。

图1 料液比与提取时间对总皂苷含量影响的三维曲面图

图2 乙醇浓度与料液比对总皂苷含量影响的三维曲面图

图3 乙醇浓度与提取时间对总皂苷含量影响的三维曲面图

本实验主要采用紫外-可见分光光度法测定，方法简便，数据准确，便于工业化生产实践的中间过程控制及成品检测控制，可为穿龙薯蓣总皂苷的生产实践提供一定的理论依据。

穿龙薯蓣皂苷类化合物药理作用研究广泛，应用于甾体激素药物和抗冠心病皂苷类药物的合成原料或中间体，具有良好的市场前景及可观的经济效益。故本文主要通过两种试验设计方法优选穿龙薯蓣总皂苷的提取工艺，并综合考虑确定穿龙薯蓣总皂苷的最佳提取工艺为：乙醇浓度为75%，料液倍数为16，提取时间为130 min/次，提取温度为85℃。

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