加味黄芪建中汤对脾虚证肺癌小鼠肿瘤转移及HIF-1α、V-ATPase c mRNA表达的影响

包素珍，陈 淇，张誉引

（浙江中医药大学，浙江杭州310053）

肺癌是一种严重危害人类健康的疾病。据统计，中国的肺癌发病率及死亡率均居恶性肿瘤中的第一位［1］，且呈逐年递增态势［2］。目前患者的 5 年生存率仍然过低，易发生肿瘤转移，而肿瘤转移是治疗失败及患者死亡的首要原因［3］。肿瘤的侵袭、转移与多种基因突变、分子通路改变有关，更是与其乏氧酸性微环境有显著的关联［4］。临床上，我们发现脾虚证是肺癌辨证中的常见证型。在前期研究基础上，本实验对加味黄芪建中汤对脾虚肺癌小鼠肿瘤转移及HIF-1α、V-ATPase c mRNA表达的影响进行了探索，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及瘤株 C57BL/6小鼠（浙江中医药大学实验动物中心），小鼠Lewis肺癌瘤株（浙江中医药大学中医临床基础实验室提供）。

1.1.2 实验药物 加味黄芪建中汤：黄芪、白芍、桂枝、甘草、生姜、大枣、饴糖、浙贝母、白花蛇舌草、仙鹤草，经水煎、过滤、灭菌，制成含生药1.00 g/mL的药液；生大黄粉加蒸馏水，50℃水浴5 h后，经旋蒸仪于50℃负压浓缩成含生药1.00 g/mL的大黄液。上述药物均在4℃冰箱保存备用。

1.1.3 试剂与仪器 RNAiso Plus RNA提取试剂、SYBR Premix EX TaqTM Ⅱ、PrimeScriptTMRT Master Mix（大连宝生物工程有限公司），V-ATPase c、gapdh引物（上海生工生物工程技术服务有限公司），HIF-1α单克隆抗体（美国Novus Biologicals公司），山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物（北京中杉金桥生物技术有限公司），7500型实时定量PCR仪（美国应用生物系统公司）。

表1 RT-PCR引物的序列、碱基数

1.2 实验方法

1.2.1 造模 C57BL/6雌性小鼠，30只，6～8 w龄，经3 w常规饲养适应环境，体重（20±2）g，随机取20只小鼠，采用苦寒泻下（大黄液灌胃，每日1 mL/20 g）、过度疲劳（每日强制游泳至耐力极限为止）及隔日禁食16 h建立脾虚证模型，连续14 d；其余小鼠在正常环境下饲养。取接种第14天的新鲜无坏死Lewis肺癌组织，加生理盐水制作成肿瘤细胞悬浊液，调整浓度，显微镜下计数为1×107个/mL。取0.2 mL上述悬浊液，注射于小鼠右侧腋部皮下。

1.2.2 分组及给药 瘤株接种后，将小鼠分为肺癌对照组、脾虚肺癌组、脾虚肺癌治疗组，每组10只。脾虚肺癌治疗组以加味黄芪建中汤灌胃，每日0.4 mL/20 g；肺癌对照组、脾虚肺癌组以等量生理盐水灌胃。

1.2.3 指标检测 观察并记录小鼠整体状态变化，如精神、活动、大便、体重、毛发等，接种瘤株后第10天处死，取肺脏，压片法计肺结节数。无菌剥取瘤块，RT-PCR法检测V-ATPase c mRNA表达，Power Vision法检测HIF-1α的表达，用Image-Pro Plus 6.0测量阳性反应物的累积光密度（IOD）。

1.3 统计学方法

用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料采用均数±标准差（±s）进行统计描述，组间比较采用t检验、单因素方差分析等。均采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状态

造模第2天起，小鼠出现便溏；第5天起，出现蜷缩、扎堆、弓背；第7天起，出现明显的体重下降，游泳时间缩短；第13天起，见毛发稀疏发黄，无光泽。符合脾虚证模型标准。

2.2 各组肺转移结节数比较

与肺癌对照组比较，脾虚肺癌组肺转移结节数增多（P＜0.05）；与脾虚肺癌组比较，脾虚肺癌治疗组肺转移结节数减少（P＜0.01）。结果见表2。

2.3 各组肿瘤组织中HIF-1α阳性表达累积光密度（IOD）值、V-ATPase c/gapdh基因表达比较

表2 各组肺转移结节数比较 （±s）

表2 各组肺转移结节数比较 （±s）

注：与肺癌对照组比较，1）P＜0.05；与脾虚肺癌组比较，2）P＜0.01

组别 肺转移结节数（个）肺癌对照组 1.40±0.690脾虚肺癌组 2.60±1.5701）脾虚肺癌治疗组 0.50±0.7042）

结果见表3。

表3 各组肿瘤组织中HIF-1α阳性表达累积光密度值比较（±s）

表3 各组肿瘤组织中HIF-1α阳性表达累积光密度值比较（±s）

注：与肺癌对照组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与脾虚肺癌组比较，3）P＜0.01

组别 HIF-1α阳性表达累积光密度值 V-ATPase c/gapdh肺癌对照组 6693.77±3577.010.02832±0.01060脾虚肺癌组 13443.40±5645.172） 0.05699±0.014241）脾虚肺癌治疗组 4208.46±2454.782）3） 0.05703±0.017881）

HIF-1α阳性表达于肿瘤细胞的细胞质和（或）细胞核，阳性细胞主要出现在肿瘤组织边缘。肿瘤坏死组织呈假阳性，正常组织呈阴性。由表3可见，与肺癌对照组比较，脾虚肺癌组HIF-1α阳性表达IOD值升高（P＜0.01），脾虚肺癌治疗组HIF-1α阳性表达IOD值降低（P＜0.01）；与脾虚肺癌组比较，脾虚肺癌治疗组HIF-1α阳性表达IOD值降低（P＜0.01）。与肺癌对照组比较，脾虚肺癌组、脾虚肺癌治疗组VATPase c/gapdh比值升高（P＜0.05）；与脾虚肺癌组比较，脾虚肺癌治疗组V-ATPase c/gapdh比值升高，但差异无统计学意义。

3 讨论

实体肿瘤的生长过程中，微环境会因肿瘤细胞增殖迅速而始终处于乏氧状态，并使得糖酵解增强，产生大量酸性代谢产物，呈酸性微环境［5］。因此，乏氧和酸性是肿瘤微环境的重要特征，并为肿瘤细胞增殖、侵袭、转移提供条件［6］。细胞乏氧反应中，HIF-1α处于核心控制地位［7］。HIF-1α上调后，可通过上调细胞运动、基质降解，下调细胞黏附分子表达等环节，促进实体瘤的侵袭与转移［8］。孙国贵等［9］分析 1488例非小细胞肺癌病理及临床资料，发现在非小细胞肺癌中HIF-1α呈高表达，且随着过表达的增加，肿瘤转移范围随之广泛。

V-ATPase广泛存在于真核细胞的胞膜系统中，能逆浓度梯度地将H+转运到细胞外［10］，是肿瘤细胞在酸性微环境中侵袭、转移的重要pH调节机制。VATPase c是位于V-ATPase V0功能区的亚基，主要功能是负责氢离子转运，是维持V-ATPase活性及功能的重要蛋白。而V-ATPase活性与肿瘤侵袭、转移密切相关［11］，V-ATPase c 高活性可上调 MMP-2 分泌，增强肿瘤细胞的浸润能力；同时V-ATPase活性增加，导致肿瘤微环境酸化，是结缔组织胶原纤维降解的重要机制之一，促进了肿瘤的侵袭与转移。

本实验通过复因素法建立脾虚小鼠模型，接种Lewis肺癌，以加味黄芪建中汤治疗。可知脾虚证肺癌小鼠的HIF-1α、V-ATPase c mRNA的表达上调，肺转移结节数增多，提示脾虚证加重了小鼠的肺癌微环境中的乏氧及酸性情况，促进肺癌的转移。予加味黄芪建中汤后，HIF-1α的阳性表达明显下降，且优于肺癌对照组，说明加味黄芪建中汤能改善肿瘤微环境中的乏氧状态，与李恒楠等［12］通过健脾法治疗脾虚证肺癌小鼠下调HIF-1α mRNA表达相符合；健脾抗癌治疗后，肺转移结节数明显下降，与艾叶盛等［13］运用黄芪建中汤抑制脾虚证肺癌小鼠肿瘤转移相符合。V-ATPase c mRNA在脾虚肺癌组和脾虚肺癌治疗组中表达无差异，考虑有以下几种可能：①加味黄芪建中汤不能下调V-ATPase c mRNA的表达及改善酸性微环境。②脾虚证肿瘤微环境及加味黄芪建中汤对肿瘤的影响，是与多种基因的表达及分子通路改变有关，可能有其他基因表达或通路改变影响了V-ATPase c mRNA的表达。③当VATPase c的活性受到抑制时，肿瘤细胞内的H+蓄积过多，pH值下降，反射性地诱导V-ATPase c mRNA的表达上调［14］。④加味黄芪建中汤的作用与V-ATPase c mRNA的表达存在一定的时间差，基因表达具有时间特异性和空间特异性。⑤V-ATPase的各级结构及蛋白间作用复杂，受多种因素调节。其具体原因，有待进一步实验研究。

诊治上采用辨证辨病相统一，针对脾虚证型，以黄芪建中汤健脾补虚；针对肺癌疾病特点，加浙贝母软坚散结，白花蛇舌草解毒抑瘤，辅以仙鹤草补虚抗癌，全方健脾解毒扶正抗癌，抑制肿瘤转移，其机制可能与改善因脾虚证而加重的乏氧微环境状态有关。

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