大黄酚对氨诱导小鼠星形胶质细胞c-fos和c-jun mRNA表达下调的影响及其相关机制

薛占霞，高永山，沈丽霞，薛贵平（河北北方学院.药学系药理学教研室，.附属第一医院心脏外科，河北张家口 075000）

大黄酚对氨诱导小鼠星形胶质细胞c-fos和c-jun mRNA表达下调的影响及其相关机制

薛占霞1，高永山2，沈丽霞1，薛贵平1
（河北北方学院1.药学系药理学教研室，2.附属第一医院心脏外科，河北张家口 075000）

目的 探讨大黄酚对氨诱导小鼠星形胶质细胞的影响及相关机制。方法 原代小鼠星形胶质细胞共分5组，分别同时加入氯化铵5 mmol·L-1+大黄酚0.1，1.0和10.0 mg·L-1（共3组），氯化铵5 mmol·L-1+细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）抑制剂UO126（10 μmol·L-1）组和氯化铵5 mmol·L-1+p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）抑制剂SB239063（10 μmol·L-1）组，处理48 h。紫外分光法测定氧化应激指标丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）的含量以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮合酶（NOS）的活性；Western蛋白印迹法检测ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平，RT-PCR检测c-fos和c-jun mRNA的表达。结果 与氯化铵5 mmol·L-1相比，大黄酚1.0和10.0 mg·L-1显著改善氨诱导的细胞氧化应激，降低了MDA和NO的含量及NOS的活性（P＜0.05），明显升高了GSH-Px和SOD的活性（P＜0.05）；大黄酚1.0和10.0 mg·L-1也明显降低氨诱导ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化增加（P＜0.05）；大黄酚0.1，1.0 和10.0 mg·L-1，UO126和SB239063均可逆转氨诱导c-fos和c-jun mRNA表达下调的作用（P＜0.05）。结论大黄酚通过抗氧化机制影响ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化，进而逆转氨诱导c-fos和c-jun mRNA表达下调。

大黄酚；星形细胞；氧化性应激；丝裂原活化蛋白激酶

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2015.06.006

肝性脑病（hepatic encephalopathy，HE）是急、慢性肝功能衰竭引起的以中枢神经系统功能紊乱为主要临床表现的一种严重综合征，其病理改变主要表现为星形胶质细胞病变［1］。研究报道，慢性氨处理原代培养小鼠星形胶质细胞，可引起细胞肿胀及对谷氨酸再摄取降低，导致细胞功能障碍［2］，而本课题组先前研究发现，氨5 mmol·L-1处理星形胶质细胞48 h，c-fos和c-jun mRNA表达下调。Fos家族成员可和Jun家族成员形成一组激活子蛋白-1（activator protein 1，AP-1）蛋白二聚体［3］。AP-1在细胞增殖、分化、凋亡、胚胎发育、炎症及其他病理过程中起着重要作用，且学习、记忆及神经发育等均与AP-1蛋白表达有关。AP-1的活性与c-fos和c-jun基因表达密切相关。c-fos和c-jun的表达受多种因素调控［4］，包括第二信使（蛋白激酶C，钙离子和环磷腺苷等）、兴奋性氨基酸（谷氨酸）、某些药物（乙酰胆碱，阿巴明和人参皂苷等）和有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路［5］。目前研究较多的是MAPK信号通路对c-fos和c-jun基因表达的影响，而MAPK磷酸化是氧化应激的一个重要后续效应［2］。MAPK包括细胞外信号调节激酶1/2（extracellular regulated kinase 1/2，ERK1/2），p38 MAPK和JNK1/2/3。研究报道，氨5 mmol·L-1处理星形胶质细胞1，3，6，12，24，48，72 h，ERK1/2的磷酸化在6 h处最高，12～24 h降低，48～72 h回升；p38 MAPK磷酸化在1 h处增加并长时维持此水平；JNK1/2/3磷酸化的峰值在3 h处，此后降低［2］。

研究表明，大黄酚（chrysophanol）对大鼠肝、脑组织过氧化脂质（lipid peroxide，LPO）生成有显著抑制作用；明显升高脑中谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，清除氧自由基，保护脑神经元细胞膜［5］。但在细胞水平上探讨大黄酚的抗氧化作用及对氨诱导小鼠星形胶质细胞的影响尚未见报道。本研究旨在探讨大黄酚对氨诱导小鼠星形胶质细胞的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器

氯化铵，规格：每瓶100 g，批号：A9434，购于美国Sigma公司；大黄酚（中国药品生物制品检定所，批号：110796-201017），制备大黄酚单体〔N，N-二甲基甲酰胺（DMF）∶吐温80∶生理盐水=1∶1∶8〕溶液。SOD检测试剂盒、GSH-Px、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；一抗包括总ERK1/2（批号：sc-94）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2，批号：sc-7383）、总p38 MAPK（批号：sc-166357）和磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK，批号：sc-166182），二抗包括山羊抗兔IgG（批号：sc-45101）和山羊抗鼠IgG（批号：sc-395763）均购自美国Santa Cruz公司。UO126和SB239063均购买于德国Calbiochem公司；Trizol购买于美国Invitrogen公司；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0购自宝生物工程有限公司（中国大连）。PCR扩增仪（Whatman Biometr，德国），低温超速离心机（北京安亭仪器设备厂，中国）。

1.2 星形胶质细胞的制备［6］及分组

选择新生1 d内小鼠，取脑，去脑膜，机械分散脑细胞并过滤。用含10%马血清培养液（g·L-1：DMEM 8.3，葡萄糖1，谷氨酰胺0.292，丙酮酸钠0.11，碳酸氢钠3.7，酚红0.015）稀释过滤后的细胞，分装到60 mm培养皿中（每皿装3 mL培养液），37℃，5%CO2培养。待细胞铺满整个培养皿时（＞95%），每皿加入双丁酰环化腺苷酸0.369 mg。

培养好的原代小鼠星形胶质细胞，随机分为正常细胞对照组、氯化铵5 mmol·L-1组、氯化铵5 mmol·L-1+大黄酚0.1，1.0和10.0 mg·L-1，氯化铵5 mmol·L-1+UO126 10 μmol·L-1和氯化铵5 mmol·L-1+SB239063 10 μmol·L-1组，处理48 h。

1.3 紫外分光法测定MDA、NO的含量和GSH-Px，SOD及NOS的活性

分别提取正常细胞对照组和实验组原代星形胶质细胞的总蛋白，BCA法测蛋白浓度。按照说明书分别测定MDA及NO含量（mmol·g-1蛋白）和GSH-Px，SOD及NOS的活性（kU·g-1蛋白）。

1.4 Western蛋白印迹法检测星形胶质细胞ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化

取制备的各处理组细胞总蛋白，每组50 mg，经10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，加1∶1000倍稀释（ERK1/2，p-ERK1/2，p38 MAPK，p-p38 MAPK）一抗，室温孵育2 h；TBS-T洗膜4次，每次8 min；加1∶3000倍稀释的二抗，孵育2 h，TBS-T洗膜4次，每次10 min。使用ECL发光液曝光。采用Window AlphaEase TM FC 32-bit软件进行条带吸光度值分析，以磷酸化的ERK1/2及p38 MAPK吸光度和总的ERK1/2 及p38 MAPK吸光度的比值表示ERK1/2及p38 MAPK磷酸化水平的指标。

1.5 RT-PCR检测原代星形胶质细胞c-fos和c-jun mRNA表达的变化

分别提取正常细胞对照组和氨中毒组原代星形胶质细胞的总RNA，紫外分光光度测定RNA浓度，参考Xue等［7］RT-PCR法测定c-fos和c-jun mRNA的表达，以TATA盒式蛋白编码基因（TATA-boxing protein，Tbp）为内参。根据试剂盒说明书加入各反应试剂进行逆转录及cDNA扩增。逆转录反应程序：30℃ 10 min，50℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃5 min；PCR扩增程序：94℃预变性2 min，94℃变性40 s，60℃（c-fos）、57℃（c-jun）、55℃（Tbp）复性40 s，72℃延伸40 s，循环37次，72℃延伸加时10 min。反应结束后琼脂糖凝胶电泳，Fluorochem 5500成像系统采集图像，以c-fos和c-jun mRNA吸光度和Tbp吸光度的比值表示c-fos和c-jun mRNA相对表达量。

c-fos，c-jun和 Tbp的引物如下：c-fos （forward：5′-ACCTAGCCGTGGAGCTTGG-3′，reverse：5′-GCCCTTGGTTGTTTACCTGG-3′，542 bp）［8］；c-jun（forward：5′-CCTTCTACGACGATGCCCTCAA-3′，reverse：5′-GGGGTCGGTGTAGTGGTGATGT-3′，228 bp）［9］；Tbp（forward：5′-CCACGGACAACTGCGTTGAT-3′；reverse：5′-GGCTCATAGCTACTGAACTG-3′，236 bp）［10］。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 大黄酚对氨诱导小鼠星形胶质细胞MDA和NO的含量及NOS，GSH-Px及SOD活性的影响

表1结果显示，与正常细胞对照组比较，氯化铵5 mmol·L-1组星形胶质细胞MDA和NO的含量及NOS活性升高（P＜0.05），同时GSH-Px和SOD活性降低（P＜0.05），说明高浓度氨导致细胞发生氧化应激；与氯化铵5 mmol·L-1组相比，大黄酚0.1 mg·L-1组，氧化应激各指标无明显变化；大黄酚1.0和10.0 mg·L-1组MDA、NO含量及NOS活性显著降低（P＜0.05），GSH-Px和SOD活性明显升高（P＜0.05），提示在细胞水平，大黄酚具有抗氧化作用。

Tab.1 Effect of chrysophanol on oxidative stress indicators in mouse astrocytes exposed to NH4Cl

2.2 大黄酚降低氨诱导小鼠星形胶质细胞ERK1/2 和p38 MAPK的磷酸化

图1结果显示，与正常细胞对照组比较，氯化铵5 mmol·L-1组ERK1，ERK2和p38 MAPK的磷酸化水平分别增加了143%，147%和139%（P＜0.05）；与氯化铵5mmol·L-1组比较，大黄酚1.0和10.0mg·L-1实验组ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平显著降低（P＜0.05），大黄酚0.1 mg·L-1组不能逆转氯化铵诱导ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平升高。

2.3 大黄酚，UO126和SB239063逆转氨诱导小鼠星形胶质细胞c-fos和c-jun mRNA的表达水平

图2结果显示，与正常细胞对照组比较，氯化铵5 mmol·L-1组，c-fos和c-jun mRNA表达分别显著下调了84%和68%（P＜0.05）；与氯化铵5 mmol·L-1组比较，大黄酚0.1，1.0，10 mg·L-1，UO126和SB239063组c-fos mRNA表达分别上调了69%，81%，80%，80%和70%（P＜0.05），c-jun mRNA表达分别上调了50%，66%，64%，67%和50%（P＜0.05）。

Fig.1 Effect of chrysophanol on ERK1/2（B，C）and p38 MAPK（D）phosphorylation in mouse astrocytes exposed to NH4Cl by Western blotting.See Tab.1 for the cell treatment.1：normal cell control；2：NH4Cl 5 mmol·L-1；3-5：NH4Cl 5 mmol·L-1+chrysophanol 0.1，1.0 or 10 mg·L-1.B，C and D were the semiquantitative results of A.±s，n=5.*P＜0.05，compared with normal cell control group；#P＜0.05，compared with NH4Cl group.

Fig.2 Effect of chrysophanol，UO126 and SB239063 on c-fos（B）and c-jun（C）mRNA expression in mouse astrocytes exposed to NH4Cl by RT-PCR.See Tab.1 for the cell treatment.1：normal cell control；2：NH4Cl 5 mmol·L-1；3-5：NH4Cl 5 mmol·L-1+chrysophanol 0.1，1.0 or 10 mg·L-1；6：NH4Cl 5 mmol·L-1+UO126 10 mmol·L-1；7：NH4Cl 5 mmol·L-1+ SB239063 10 mmol·L-1.B，C were the semiquantitative results of A.±s，n=5.*P＜0.05，compared with normal cell control group；#P＜0.05，compared with NH4Cl group.

3 讨论

本研究发现，大黄酚可消除氨诱导小鼠星形胶质细胞氧化应激，并进一步抑制ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平的升高，从而逆转氨诱导c-fos和c-jun mRNA表达下调的作用。提示大黄酚可通过抗氧化应激的机制影响并保护星形胶质细胞的功能。但大黄酚作为大分子量有机物，不易通过细胞膜，推测大黄酚主要通过抑制扩散到细胞外的超氧自由基而起到抗氧化作用。

研究报道，c-fos和c-jun基因表达与MAPK磷酸化水平呈正相关［11］。但本课题研究发现，慢性高浓度氨处理星形胶质细胞，ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平升高，但c-fos和c-jun mRNA表达下调，提示c-fos和c-jun mRNA表达亦受其他因素调控。据文献报道，N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受体激动剂可诱导纹状体c-fos基因表达［3］。急性或慢性氨中毒均可影响NMDA受体的表达。在急性大剂量氨中毒大鼠模型的大脑皮质、海马、小脑等区域，NMDA受体被活化［12］，但大鼠慢性氨中毒，海马区NMDA受体功能下降［13］。结合本课题现有研究结果推测星形胶质细胞慢性氨中毒，NMDA受体功能下降，导致c-fos和c-jun mRNA表达下调，且NMDA受体功能的改变可能受MAPK信号通路调控。因此大黄酚逆转氨诱导c-fos和c-jun mRNA表达下调的机制还有待进一步研究。

［1］Butterworth RF.Hepatic encephalopathy［J］.Alcohol Res Health，2003，27（3）：240-246.

［2］Jayakumar AR，Panickar KS，Murthy ChR，Norenberg MD.Oxidative stress and mitogen-activated protein kinase phosphorylation mediate ammonia-induced cell swelling and glutamate uptake inhibition in cultured astrocytes［J］.J Neurosci，2006，26（18）：4774-4784.

［3］Sun KH.Advance in research of expression of c-fos gene in learning and memory and exercise system（review）［J］.Chin J Rehabil Theory Pract（中国康复理论与实践），2008，14（6）：542-544.

［4］Zhang YQ，Mei J.The effect of learning and memory on c-fos gene expression in brain［J］.Chin Bull Life Sci（生命科学），2000，12（5）：228-230，216.

［5］Li SJ，Li CG，Hou Y，Zhang DS.Advances of chrysophanol on anti-aging research［J］.J Hebei North Univ（Med Ed）〔河北北方学院学报（医学版）〕，2009，26（1）：69-71.

［6］Hertz L，Peng L，Lai JC.Functional studies in cultured astrocytes［J］.Methods，1998，16（3）：293-310.

［7］Xue Z，Li B，Gu L，Hu X，Li M，Butterworth RF，et al.Increased Na-K-ATPase alpha2 isoform gene expression by ammonia in astrocytes and in brain in vivo［J］.Neurochem Int，2010，57（4）：395-403.

［8］ Elkeles A，Juven-Gershon T，Israeli D，Wilder S，Zalcenstein A，Oren M.The c-fos proto-oncogene is a target for transactivation by the p53 tumor suppressor ［J］.Mol Cell Biol，1999，19（4）：2594-2600.

［9］Zearfoss NR，Alarcon JM，Trifilieff P，Kandel E，Richter JD.A molecular circuit composed of CPEB-1 and c-Jun controls growth hormone-mediated synapticplasticity in the mouse hippocampus［J］.J Neurosci，2008，28（34）：8502-8509.

［10］El Marjou M，Montalescot V，Buzyn A，Geny B. ModificationsinphospholipaseDactivityand isoform expression occur upon maturation and differentiation in vivo and in vitro in human myeloid cells［J］.Leukemia，2000，14（12）：2118-2127.

［11］Feng DY，Zheng H，Jiang HY，Tan Y，Cheng RX. Relationship between MAPK phosphorylation and the expression of c-fos and c-jun proteins in hepatocellular carcinomas and their surrounding liver tissues［J］.J Clin Exp Pathol（临床与实验病理学杂志），2000，16（6）：441-443.

［12］Zwingmann C，Desjardins P，Hazell A，Chatauret N，Michalak A，Butterworth RF.Reduced expression of astrocytic glycine transporter（Glyt-1）in acute liver failure［J］.Metab Brain Dis，2002，17（4）：263-273.

［13］Marcaida G，Miñana MD，Burgal M，Grisolía S，Felipo V.Ammonia prevents activation of NMDA receptors by glutamate in rat cerebellar neuronal cultures ［J］.Eur J Neurosci，1995，7（12）：2389-2396.

（来稿日期：2015-05-21接受日期：2015-11-17）

（本文编辑：贺云霞）

Effect of chrysophanol on down-regulated expression of c-fos and c-jun mRNA in mouse astrocytesexposed to ammonia and related mechanisms

XUE Zhan-xia1，GAO Yong-shan2，SHEN Li-xia1，XUE Gui-ping1
（1.Department of Pharmacology，2.The First Affiliated Hospital Cardiac Surgery，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China）

OBJECTlVE To investigate the effect and mechanisms of chrysophanol on the expression of c-fos and c-jun mRNA induced by ammonia chloride（NH4Cl）in mouse astrocytes.METHODS Primary mouse astrocytes were cultured with NH4Cl 5 mmol·L-1+chrysophanol 0.1，1.0 or 10.0 mg·L-1，or NH4Cl 5 mmol·L-1+extracellular regulated kinase1/2（ERK1/2）inhibitor UO126 10 mmol·L-1and NH4Cl 5 mmol·L-1+p38 mitogen-activated protein kinase（p38 MAPK）inhibitor SB239063 10 mmol·L-1for 48 h. The levels of glutathione peroxidase（GSH-Px），superoxide dismutase（SOD），malondaldehyde（MDA），nitric oxide（NO）and nitric oxide synthase（NOS）were detected by UV spectrophotometry.The phosphorylation levels of ERK1/2 and p38 MAPK were detected by Western blotting.The expression of c-fos and c-jun mRNA was detected by RT-PCR.RESULTS Compared with NH4Cl 5 mmol·L-1group，ammonia-induced astrocytes oxidative stress was improved by chrysophanol（1.0 and 10.0 mg·L-1）. The content of MDA and NO and the activity of NOS were reduced（P＜0.05）.The activity GSH-Px and SOD was increased（P＜0.05）.The phosphorylation level of ERK1/2and p38 MAPK induced by ammonia was reduced in chrysophanol groups（P＜0.05）.Ammonia-induced c-fos and c-jun mRNA expression downregulation was reversed by chrysophanol（0.1，1.0 and 10.0 mg·L-1）and UO126 and SB239063（P＜0.05）.CONCLUSlON Chrysophanol may improve the downregulated expresion of c-fos and c-jun mRNA in mouse astrocytes exposed to NH4Cl by anti-oxidative stress by inhibiting the ERK1/2 and p38 MAPK phosphorylation.

chrysophanol；astrocyte；oxidative stress；MAP kinase

The project supported by Outstanding Youth Fund of Bureau of Education in Hebei Province （Y2012002）；and Natural Science Foundation of Hebei Province（H2012405016）

SHEN Li-xia，E-mail：shenlixiacn@sina.com，Tel：13932328109

R285，R966

A

1000-3002（2015）06-0912-05

河北省教育厅优秀青年基金资助项目（Y2012002）；河北省自然基金资助项目（H2012405016）

薛占霞，女，讲师，医学博士，主要从事神经药理学研究，E-mail：xuezhanxia412@163.com，Tel：18931311063

沈丽霞，E-mail：shenlixiacn@sina.com，Tel：13932328109