Wnt信号通路在绵羊不同大小卵泡中的表达

赵妙妙，姜晓龙，陈建伟，黄　洋，姚晓磊，曹　霞，李鹏飞，吕丽华*

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）

Wnt信号通路在绵羊不同大小卵泡中的表达

赵妙妙1，姜晓龙1，陈建伟1，黄洋1，姚晓磊1，曹霞1，李鹏飞2，吕丽华1*

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）

为研究Wnt信号通路在绵羊不同大小卵泡中的表达情况，本试验选取了Wnt信号通路中的4个关键基因，利用荧光定量PCR技术检测其在绵羊大、中、小卵泡中的相对表达量。结果显示，CTNNB1、FZD6基因在大卵泡中表达相对较多，DVL1在不同大小卵泡中的表达量无明显差异，AXIN2在中、小卵泡中表达量相对较多。随着绵羊卵泡的增大，Wnt信号通路在卵泡中的表达也呈现出递增趋势，因此Wnt信号通路能够促进绵羊卵泡的发育，并且可能与雌激素的分泌有关。

绵羊；卵泡；Wnt信号通路

卵泡是哺乳动物卵巢上的基本单位。目前人们根据卵泡成腔与否，把卵泡分为无腔卵泡和有腔卵泡。无腔卵泡包括原始卵泡、初级卵泡和没有成腔的次级卵泡。有腔卵泡由四个不同部分构成：壁层细胞、颗粒细胞、卵丘细胞和卵母细胞［1］。自Wnt被发现以来，Wnt信号通路逐渐受到了人们的广泛关注。目前已知的Wnt信号通路［2～6］主要有3条：（1）经典的Wnt/β-catenin（CTNNB1）信号通路；（2）平面的细胞极性通路（planar cell polarity pathway）；（3）Wnt/Ca2+通路。其中，人们对Wnt/β-catenin信号通路了解最为深刻。当细胞未受到刺激时，轴蛋白（AXIN2）结合到CTNNB1/糖原合酶激酶（CSK3）/结肠癌抑制因子（APC）复合体当中，导致CTNNB1迅速降解，信号传导通路关闭；而当经典Wnt/β-catenin信号通路被激活时，Wnt配体与受体卷取蛋白（Frizzled，FZD）以及LDL受体相关蛋白（LRP）结合形成三聚体，从而激活蓬乱蛋白（Dishevelled1，Dsh1/DVL1），使DVL1与AXIN2相结合，导致AXIN2/CSK3/APC/CTNNB1的复合体被破坏，CTNNB1无法被降解。因此，CTNNB1可以进入细胞核内，对基因的转录进行调控［7］。目前已有大量研究证明，Wnt信号通路与哺乳动物的繁殖存在密切的联系。Vainio S［8］等发现，在LH峰后的4～12 h，Wnt信号通路受体Frizzled定位于排卵卵泡的颗粒细胞上。本试验选取了Wnt信号通路中的4个关键基因，探究Wnt信号通路在绵羊不同大小卵泡中的表达情况，为Wnt信号通路功能的进一步研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1试验动物及卵巢样品

本试验选用山西省清徐县绵羊屠宰场性成熟绵羊的健康卵巢。

1.2主要试剂

Trizol、DEPC（Invitrogen公司，美国）、固相RNase清除剂（Andybio公司，美国）、PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒、dNTP、DNA MarkerDL1000（Takara，大连）、SYBR®Premix Ex TaqTM II（Takara，大连）。

1.3卵泡及颗粒细胞的分离

将采集的健康卵巢放入灭菌的4℃杜氏磷酸缓冲液（DPBS）中，在2 h内送至实验室。在超净台内，用眼科剪认真分离大卵泡（卵泡直径＞5 mm），中卵泡（3 mm＜卵泡直径＜5 mm）和小卵泡（卵泡直径＜3 mm），用无菌的杜氏磷酸缓冲液（DPBS）漂洗两次。剪开卵泡并放入盛有生理盐水的小表面皿中，用刮刀轻轻刮动卵泡内壁。分别收集大、中、小卵泡的颗粒细胞，加入适量Trizol，-80℃储存，提取RNA备用。

1.4总RNA的提取及反转录

将前面-80℃的储存液从冰箱取出，用Trizol法分别提取大、中、小卵泡颗粒细胞的总RNA［10］。分别以上述提取出的RNA为模板，按照PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒说明，加入1 μL gDNA Eraser，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，2 μL RNA，RNase Free定容到10 μL。反应条件设为42℃2 min，4℃∞。之后再加入1 μL RT Primer Mix，4 μL 5×PrimeScript®Buffer 2，1 μL PrimeScript®RT Enzyme Mix I，RNase Free定容到20 μL。反应条件设为37℃15 min，85℃5 s，4℃∞。反应结束后，检测产物纯度及浓度。

1.5引物设计与合成

根据NCBI上绵羊的各目的基因的已有序列或预测序列，利用Primer 3和Oligo 6软件设计目的基因的引物；以绵羊β-Actin基因作为内参基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列信息见表1。

1.6qRT-PCR反应

以绵羊大、中、小卵泡颗粒细胞的cDNA为模板，构建20 μL qRT-PCR反应体系：SYBR®Premix Ex TaqTM II（2×）10 μL，Rox Reference Dye（50×）0.4 μL，PCR Forward/Reverse Primer（10 μmol·L-1）0.8μL，cDNA模板2.0μL，ddH2O 6 μL，反应条件为：95℃变性30 s，95℃5 s，60℃25 s，45个循环。扩增后利用其CT值分析结果。

表1　R荧光定量PCR引物序列

1.7统计分析

试验数据用SPSS 18.0进行分析，采用单因素方差分析和显著性检验的方法。qRT-PCR相对表达量结果用平均值±标准差来表示，采用△△CT的计算方法，相对表达量=2-△△CT。各基因表达量均经内参β-Actin校正。

2　结果

2.1内参β-Actin及通路基因CTNNB1、FZD6、DVL1、AXIN2的扩增曲线和熔解曲线

图1为内参β-Actin及Wnt信号通路中4个关键基因CTNNB1、FZD6、DVL1、AXIN2的扩增曲线和熔解曲线。由图1中可见，各扩增曲线拐点清晰，曲线平滑，基线期及平台期较平稳，每个基因各样品的CT值都很接近，说明该试验系统误差小。各熔解曲线为单峰，即产物单一，说明该荧光定量试验可信度较高。

2.2CTNNB1、FZD6、DVL1、AXIN2在不同大小卵泡中的表达差异

利用△△CT法对CTNNB1、FZD6、DVL1、AXIN2在绵羊大、中、小卵泡颗粒细胞中的表达量进行分析，统计结果见图2。由图2可以看出CTNNB1基因在大卵泡中的表达量显著高于中卵泡和小卵泡；FZD6基因在大卵泡和中卵泡中的表达量显著高于小卵泡；DVL1基因在大、中、小卵泡中没有表现出明显差异；AXIN2基因在中卵泡和小卵泡中的表达量显著高于大卵泡。

图1　Rβ-Actin、CTNNB1、FZD6、DVL1、AXIN2基因的扩增曲线和熔解曲线

图2　RCTNNB1、FZD6、DVL1、AXIN2在不同大小卵泡中的表达差异

3　讨论

卵泡的生长机制相当复杂，众多激素和生长因子通过内分泌、自分泌及旁分泌途径调节其生长发育。Wnt信号通路可调控多种发生过程，如细胞程序性死亡、增殖、分化和凋亡等［11］，目前已有大量研究证明，其在哺乳动物繁殖也存在重要作用。本试验结果显示，在Wnt信号通路中的4个关键基因中，CTNNB1和FZD6基因在大卵泡中表达相对较多，在小卵泡中表达相对较少。在Wnt信号通路中，AXIN2越多，蛋白复合体降解的CTNNB1就越多，通路发挥的作用越小。因此AXIN2在大卵泡中表达量显著少于中卵泡和小卵泡，说明通路在大卵泡中的表达高于中小卵泡。DVL1基因在大中小卵泡中的表达虽没有表现出显著地差异，但也存在逐渐下降的趋势。综上所述，随着绵羊卵泡的不断增大，Wnt信号通路在卵泡中的表达量逐渐升高，这与Gupta［12］对于Wnt信号通路在不同时期的牛卵泡发育过程中的表达研究结果一致。此外，目前已有研究证实，随着卵泡的增大，雌激素浓度在不断增加［13］。因此Wnt信号通路在绵羊大、中、小卵泡中的表达与雌激素浓度正相关，所以Wnt信号通路可能对卵泡中雌激素的分泌有影响。结论，Wnt信号通路可以促进绵羊卵泡的生长，并且可能与卵泡中雌激素的分泌有关。

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S814；S826.3

A

1005-2739（2015）05-0003-04

2015-07-10

国家自然科学基金（31172211）；山西省回国留学人员科研资助项目（2014-重点5）；山西农业大学科研管理费资助重大项目和标志性成果培育项目（71060003）

赵妙妙（1989-），女，山西大同人，硕士研究生，研究方向：动物遗传育种与繁殖。E-mail：1203418618@qq.com

吕丽华，E-mail：sxaullh@yahoo.com.cn