影响黑萨福克绵羊体内原核胚生产的因素

柴孟龙，魏 巍，何长久，王 军，卫喜明，张洪涛，陈 洋，刘大森，吕文发* ，刘国世*

(1.吉林农业大学 动物科技学院，吉林 长春130118;2.中国农业大学 动物科技学院，北京100193;3.黑龙江省农垦科学院 畜牧兽医研究所，黑龙江 哈尔滨150090;4.东北农业大学 动物科技学院，黑龙江 哈尔滨150030)

原核胚显微注射是当前生产转基因动物最可靠、最常用的方法。有研究表明，原核胚期进行外源DNA 注射的融合效率要显著高于2 ～4 细胞期胚胎［1］。因此，应用原核胚显微注射生产转基因动物就需要大量同步发育的原核胚，如果单靠动物自身排卵，不但产生的胚胎少、质量不稳定且难以保持同步性。因而开展胚胎移植，探索建立高效的原核胚生产技术体系就显得尤为重要。

黑萨福克绵羊具有巨大的经济效益，开展转基因定向培育可充分发挥优秀母羊在品种改良和群体扩繁中的潜力，使优秀基因高效地保留和遗传下去［2，3］，有效缩短繁殖时间，快速扩大种群规模。为了提高黑萨福克绵羊体内原核胚生产效率，本试验研究了不同FSH 剂量、不同超排方法、不同授精方式及不同季节对超排效果的影响，以期为生产足够数量的高质量原核胚摸索出一套切实可行的方案。

1 材料和方法

1.1 试验动物及药品

1.1.1 试验用羊

无繁殖疾病、体重在65 ～82 kg 的经产母羊作供体;膘情良好、无繁殖疾病的1 ～5 岁母羊作受体。采精用纯种公羊，精液品质检测优良。

1.1.2 药品与试剂

促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、孕马血清促性腺激素(PMSG):宁波三生药业有限公司生产;阴道栓(CIDR):新西兰产EAZI- BREED-CIDR，20 个/袋;氯前列烯醇(PG):上海计划生育研究所产;Holding 培养液:新西兰生产，50 mL/袋;酒精、碘酒、新洁尔灭、抗生素、生理盐水、青霉素、链霉素等为国产。

1.1.3 设备及器械

冲卵管、细菌滤器、移植枪、实体显微镜、恒温台等。

1.2 试验方法

1.2.1 供体羊超排处理和配种

CIDR+FSH+PMSG 4 天8 针注射法:黑萨福克供体羊发情周期内任意一天阴道植入CIDR，至第10 天注射FSH，剂量递减，第13 天时取出CIDR，注射PMSG。供体羊在停止注射激素后48 h内发情，公羊试情至不接受交配为止，并注射LH 110 IU/只。

CIDR+FSH+PG 4 天8 针注射法:方法同上，只将注射PMSG 改为注射PG。

采用两种输精方式，第1 组:开膣器输精辅以自然交配;第2 组:腹腔内窥镜输精。人工采集种公羊精液，镜检，活力达0.6 以上方可用于人工输精。

1.2.2 胚胎质量鉴定

配种后第5 天手术法从子宫角冲卵，在40 倍体式显微镜下根据受精卵的形态、色泽、分裂球的大小和数量、均匀度、细胞的密度等，及变化情况确定受精卵发育期、未受精卵以及胚胎发育阶段。

1.2.3 受体处理与腹腔内窥镜法胚胎移植

使用CIDR + PMSG 法，与供体羊同步埋植CIDR，在供体羊撤栓前一段时间撤除CIDR，注射PMSG。公羊试情，记录发情时间。

采用腹部手术法处理受体羊，腹腔内窥镜观察，单侧卵巢1 ～3 个黄体可用于移植。

1.2.4 供受体羊术后处理

供受体羊术后在小圈内观察1 ～2 d，圈舍应保持清洁干燥以防感染，保证术后恢复良好。

1.2.5 数据处理

使用Spss18.0 软件对超排供体黄体数、可用胚胎数分别进行x2检验。

2 结果与分析

2.1 FSH 剂量对超排效果的影响

CIDR+FSH +PMSG 方案处理的20 只黑萨福克供体绵羊，在体重相近情况下，按FSH 的注射剂量分为180 ～240 IU 组、260 ～320 IU 组两组(见表1)。试验结果表明，180 ～240 IU 组平均黄体数(15.87 个/只)、平均获卵数(12.78 枚/只)、平均可用胚胎数(13.88 枚/只)、移植妊娠率(75.00%)均高于另一组(P ＜0.05)。

2.2 不同方法对超排效果的影响

通过对CIDR+FSH+PMSG 4 天8 针注射法和CIDR+FSH + PG 4 天8 针注射法方案比较发现，前者在平均黄体数(15.00 个/只)、平均冲卵数(14.06 枚/只)、平均可用胚数(13.80/只)和移植妊娠率(71.43%)方面均高于CIDR + FSH + PG 4天8 针剂法(P ＜0.05)(见表1)。

2.3 不同授精方式对超排效果的影响

表3 所示，对黑萨福克供体采用开膣器输精结合自然交配、腹腔内窥镜输精两种配种方式比较发现，腹腔内窥镜输精法供体冲出卵子受精率94.62%、平均可用胚数(10.66 枚/只)高于开膣器输精+自然交配的配种方式(P ＜0.05)。

2.4 繁殖与非繁殖季节比较对超排效果的影响

春季、秋季(间隔6 个月)两次超排结果对比发现，繁殖季节秋季平均黄体数(12.00 个/只)、平均冲卵数(11.35 枚/只)、可用胚数(10.76 枚/只)高于春季的效果，秋季胚胎移植妊娠率59.15% 极显著高于春季妊娠率38.15% (P ＜0.01)。

表1 不同FSH 剂量对黑萨福克绵羊超排效果的影响

表2 黑萨福克不同超排方案的比较

表3 不同授精方式对黑萨福克绵羊超排效果的影响

表4 不同季节对萨福克绵羊超排效果的影响

3 讨论

3.1 不同FSH 剂量对超排效果的影响

FSH 的使用剂量对绵羊超排效果有很大影响，外源FSH 可以解除优势卵泡对其它卵泡发育的抑制，在合适时间注射FSH，可获得更多胚胎［4］。国内有报道萨福克羊，FSH 剂量区间126 ～150 IU。本试验在体重相近的情况下，按FSH 剂量设定为180 ～240 IU 组、260 ～320 IU 组。结果表明，180～240 IU 组效果较好，说明FSH 注射剂量有一个相对固定的参考范围，在合理区间内相同来源的激素超排效果随剂量上升而有增大趋势，过低过高都不利于超排。

3.2 不同超排方法对超排效果的影响

孕酮栓埋植天数会对绵羊发情排卵产生影响［5］，同时个体差异导致卵巢对外源激素也会产生不同反应，诱导分泌的雌激素水平的不同使卵泡群产生多种动态变化［6，7］。孕酮栓中的孕酮会提高血液孕酮浓度，从而抑制LH 和FSH 的释放，撤栓后孕酮水平降低刺激卵泡发育成熟形成了黄体。目前国内羊只胚胎生产中，平均采集可用胚5 ～7枚［8～10］。本研究的两个超排方案获胚数与此前国内报道接近，其中CIDR + FSH + PMSG 法较为理想，推测PMSG 作用平缓，卵巢体积不会剧烈增大，处理后的卵巢易于恢复，排卵率高，而注射PG 刺激较大，PG 剂量对黄体的发育有着极为重要的影响。

3.3 不同授精方式对超排效果的影响

Sayre 等(1997)和Ghalsasi 等(1996)对腹腔镜与子宫颈输精的效率进行了比较，发现前者胚胎受精率高于后者［11］。Fair 等(2005)用内窥镜法对两个品种的绵羊进行了输精，胚胎受精率相近，而用开膣器输精则差异显著［12］。说明品种对胚胎受精率不会产生影响。开膣器输精是目前羊场较为常用的方式，可子宫角输精，易于掌握且精液可较少浪费，提高配种效率。而腹腔镜技术具有对母羊生殖器官损伤小、输精位置精准创伤小的优点，但对操作技术要求较高。内窥镜输精法能够提高受精率这一结论与国内已有报道一致，在平时现场操作中，考虑到腹腔镜技术要求、对羊只产生的应激效应及人工费用，开膣器输精配合自然交配的输精方式不失为一种较为经济易行的方式，但就超排效果而言，还是应该采用腹腔镜技术。

3.4 不同季节对超排效果的影响

有研究表明，非繁殖季节，胚胎受精失败几率较高［13］。本试验超排效果比较发现，在绵羊自然发情季节秋季的效果明显好于春季，与张果平等［14］对无角陶赛特羊秋冬两季的回收胚胎数显著高于春季结果一致。但桑润滋等［15］对波尔山羊在春、夏、秋三个季节的超排效果却没有明显变化，可能与品种间差异有关。重复超排可使优秀种羊高效重复使用、提高优质种羊利用率、有效降低成本。但手术常造成供体的生殖器官粘连。为保证超排效果，应当适当延长羊只恢复时间，同时尽量术中减少出血及加强术后防粘连药物的使用和消毒处置。多次重复超排冲卵，尽管存在生殖器官粘连现象，但如果手术次数保证在3 次以内并不会影响正常的繁殖机能，这对获得较好的超排效果，对充分利用优秀种绵羊、降低原核胚生产成本具有十分重要的意义。

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