杜泊绵羊胚胎移植技术在哈密地区应用效果观察

罗生金，阿布都力·尼亚孜，热孜万古丽，吴荣虎

(1.新疆哈密地区畜牧工作站839000;2.新疆哈密地区伊吾县畜牧工作站839300)

胚胎移植又称受精卵移植，最早于1890 ～1900年W.Heape 将安哥拉兔和荷兰兔的受精卵分别移植到比利时兔的输卵管内，分别获得仔兔2只。通过长期试验直到1977年发达国家才开始商业化应用。我国胚胎移植从1973年开始在卡拉库尔羊上实施并产羔。1991 ～1995年，该技术逐渐成熟，开始由实验室向生产中应用［1］。羊的胚胎移植技术属于生物工程技术范畴，这是指一只母羊(供体)超数排卵发情并经过配种后，在一定时间内从其生殖道取出胚胎或者由体外受精等技术获得的胚胎，然后把这些胚胎移植到另外一只与供体羊同期发情或情期相同，但未经配种的受体母羊生殖道的相应部位，外来胚胎在受体子宫着床并继续发育成长，最后产下供体羊的后代，即通常所说的“借腹怀胎”。在羊的繁殖过程中，胚胎移植作为一种新的快速繁育纯种羊的方法被公认和接受［2］。

为了丰富哈密地区肉羊品种，2013年伊吾县喀尔里克公司北牧种羊场从内蒙古引进黑头杜泊种公羊和母羊进行纯种繁育。但由于肉羊品种价格昂贵，运输路途遥远，费用高，引进肉羊数量有限，纯种繁育进度缓慢，繁殖率低。为了加快肉羊纯繁进度，2014年9月邀请新疆畜牧科学院专家来喀尔里克公司羊场进行哈密地区首次杜泊绵羊鲜胚移植，以提高肉羊纯种繁殖率，加速我区舍饲肉羊改良力度。笔者服务于本公司并全程参与了胚胎移植过程。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供体羊及种公羊

选取伊吾县喀尔里克公司北牧种羊场提供的黑头杜泊母羊79 只做供体羊，体重在60 ～70 kg，年龄1.5 岁，初产母羊，膘情中等以上。在准备期制定饲养方案保证供体羊均衡摄入所需营养物质，同时做好饲喂、饮水、补盐、运动、试情等工作。种公羊为本场2 岁以上黑头杜泊种公羊，遗传性能稳定，系谱清晰，体型外貌达到品种标准，体格结实，健康无病，雄性特征明显，精液品质良好，膘情8 成以上。

1.1.2 受体羊与试情公羊

受体羊为本地哈萨克羊，无繁殖性疾病及传染病，经检测结核病与布病均为阴性。3 ～5 岁的经产母羊，体格健壮，体重40 kg 以上，中等以上膘情。将受体羊分群，佩戴耳标，制定防疫计划，分期疫苗免疫和驱虫，实行放牧+ 补饲的方式进行“短期优饲”。同时要观察和记录羊群情况，及时剔除老、弱、病、残羊只，确保受体羊整体质量。选健康无病、性欲好的本地哈萨克成年公羊做试情公羊。

1.1.3 仪器设备

专用胚胎移植手术架、内窥镜、B 超仪、子宫钳、体视显微镜、水浴锅、、恒温台、注射器若干、冲卵管、检卵针、移植管、培养皿、曲别针、小弯缝合针、12 号缝合线、剃毛刀、剪毛剪等。

1.1.4 试验药品

PG、FSH、LHRH-A3 等激素为宁波激素制品厂生产;冲卵液(PBS)由新疆畜牧科学院提供，保存液新西兰生产;静松灵注射液、利多卡因注射液、黄体酮注射液、160 万IU 青霉素、100 万IU链霉素、250 mL 甲硝唑注射液。

1.2 方法

1.2.1 供体羊的超排处理

2014年9 月对供体绵羊进行同期发情处理。首先对供体羊全群注射PG，每只1 mL。在24 ～72 h内每天2 次试情，做好发情记录，按照发情先后顺序分组、编制程序。对于有发情周期供体母羊根据受体羊数量在发情后9 ～12 d 开始超排。本次采用FSH 逐日递减法进行处理(见表1)，对于没有发情的供体羊采用埋栓法处理，用同样的方法进行超排处理。在第6 次超排注射时撤掉CIDR。在超排处理的第4 天取栓，供体羊在取栓的第2 天进行试情，发情后第1 次配种后肌注LHRH-A3 半支，供体羊采用上午发情下午配种，下午发情第2天早晨配种，每只羊配种2 次。

表1 超排处理程序

1.2.2 受体羊处理

对受体羊第1 次注射PG 时与供体羊同步，第2 次注射PG 时比供体羊提前12 h，第2 次注射后24 ～72 h 观察发情状况并做好标记与记录备用。

1.2.3 供体羊冲卵

供体羊配种后第7 天进行手术法冲卵。首先将供体羊采取前低后高半仰卧姿势保定在手术架上，术部剃毛- 备皮- 消毒，全身麻醉、局部浸润麻醉。术部铺垫一次性创巾，在腹部偏右侧距乳房基部3 ～4 cm 处做一长4 cm 的纵向切口，逐层切开。切开腹膜后，将食指和中指伸入腹腔，在骨盆腔前缘探寻子宫角，将子宫牵引至切口外，再把卵巢引出检查黄体发育情况。如果黄体发育良好，用套有胶管的肠钳夹在子宫角分叉处，开始冲卵。先用一端带有头皮静脉针的导管连接吸入预热35 ℃冲卵液20 ～30 mL(一侧用液50 ～60 mL)，注射器从输卵管中部向宫管结合部方向扎入，缓慢推动注射器，感觉阻力小说明已经顺入输卵管，另一端将硅胶管连接集卵杯的钝性冲卵针头从肠钳夹基部上方子宫体迅速扎入，冲卵液经硅胶管收集于集卵杯内，最后用两手拇指和食指将子宫捋一遍。另一侧子宫角用同样方法冲洗。进针时避免损伤血管，推注冲卵液时用力和速度应适中。两侧冲洗完毕，将子宫送入腹腔，为防止粘连和腹膜炎，向腹腔注入34 ℃的0.9%生理盐水250 mL +160 万IU 青霉素+100 IU 链霉素与250 mL 甲硝唑注射液。按手术常规处理，闭合腹腔。

1.2.4 胚胎检查

操作室温保持在20 ～25 ℃，取三个培养皿放置于24 ℃恒温台上，加入适量保存液备用。将收集好的冲卵液移去上层液，取底部少量液体移置平皿内，静置后，在体视镜下先在低倍(10 ～20 倍)下检查胚胎数量，然后在较大倍数(50 ～100 倍)下观察胚胎质量。根据受精卵的形态、色泽、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度、与透明带的间隙以及变性情况等，将胚胎分为A、B、C 3 个等级。发情后第7 天回收的受精卵在正常发育时应处于致密桑椹胚至囊胚阶段。凡在16 细胞以下的受精卵及变性细胞超过一半的胚胎均属等外。凡卵子的卵黄未形成分裂球及细胞团的均列为未受精卵。根据胚胎鉴定结果做好统计记录。胚胎保存:吸管先吸入少许PBS 液，再吸入胚胎，将胚胎吸至第1 个培养皿内，在培养皿的不同位置缓慢冲洗卵3 ～5次。依次在第2 个培养皿内重复冲洗，然后把全部胚胎移至第3 个培养皿。1 个供体的卵放在同1 个皿内，于24 ℃恒温台上加盖保存，待受体羊鲜胚移植，一般保存4 ～5 h。

1.2.5 腹腔镜法移植

将受体羊体位45° ～60°倾斜倒立保定法保定在手术架上，剃毛-备皮-消毒后，用手术刀在乳房前腹中线两边各切开1 ～1.5 cm 的切口，一侧套管针刺入腹腔后，抽出针芯。将观察镜经管套送入腹腔，借助腹腔内窥镜和子宫钳翻动、拨开卵巢系膜，暴露卵巢。通过目镜观察黄体发育情况，按突出卵巢的直径和颜色分为优、中、差3 个等级，优:0.6 ～0.8 cm，颜色深红;中:0.5 cm，颜色鲜红;差:0.3 cm，颜色粉红。将判定合格黄体一侧的子宫角前端用子宫钳引出腹腔切口外，用曲别针避开血管在子宫角前端扎孔，用装好胚胎的移植针，对准针孔，确认移植针在子宫角内腔内，将胚胎注入到子宫角内。移植后将子宫角恢复原位，切口缝合1 针，对于中级黄体酌情注射黄体酮注射液，解除保定。

1.2.6 供、受体羊术后处理

供、受体羊术后在小圈内观察1 ～2 d。圈舍应保持干燥、清洁，加强护理，防止感染。对于妊娠受体羊按照肉羊营养标准调整日粮，妊娠后期应加强管理，防止流产，并做好接产和保羔育幼工作。

1.2.7 妊娠检查

在受体羊妊娠45 d 时，经B 超检查妊娠286只，受胎率为76.2%。

2 结果与分析

2.1 受体羊同期发情效果与胚胎利用状况

对460 只受体羊进行两次PG 同期发情处理，发情389 只，同期发情率达84.5%。将443 枚可用胚胎移375 只受体羊，其中237 只受体移入单胚，138 只受体移入双胚，移植成功率达76.2%。但从处理的389 只受体羊看，有7 只黄体发育不太好，4 只有包虫病做淘汰处理，2 只未排卵。同期发情处理的效果比较好，黄体发育良好，受体羊可利用率达96.4%。

表2 受体羊同期发情与移植

2.2 供体羊冲胚

本次鲜胚移植共处理79 只供体，其中有1 只供体冲出胚胎24 枚，可用胚胎为21 枚，有11 只未冲出可用胚胎，有1 只仅冲出2 枚胚胎。本次冲出可用胚胎485 枚，其中42 枚A 级胚胎做了冷冻处理。平均冲出可用胚胎6.1 枚/只。采用PG 两次注射法冲出可用胚胎平均数为6.2/只，采用CIDR 法冲出可用胚胎平均数为5.2 枚/只，两者差异不显著(P ＞0.05)。

2.3 移植胚胎数、胚胎质量对受胎率的影响

通过这次鲜胚移植，共移植可用胚胎443 枚，共移植受体羊375 只。结果表明:移植A 级胚胎受胎率明显高于B、C 级胚胎，胚胎利用率高，通过t检验差异均显著(P ＜0.05)，且羔羊成活率高。

3 讨论

3.1 本次胚胎移植用PG 注射法与孕酮阴道海绵栓结合法对供体羊进行处理，再结合注射FSH 递减法对绵羊进行超排处理是一种有效的处理方法。这次处理用PG 法处理处理有11 只羊没有冲出可用胚胎，对于不发情羊用CIDR 法处理全部冲出可用胚胎，可见供体羊CIDR 法处理效果要好些。本次供体羊均为初产羊也是超排不利的因素之一。试验中采用递减法注射FSH 剂量为100 IU/只。据张良［6］采用120 IU ～132 IU 的剂量获得超排回收可用胚胎8.8 ～9.4 枚是最佳首选剂量。适合于我区肉羊FSH 超排剂量有待于在今后的对比试验中进一步完善。

表3 采用PG 法与CIDH 法比较

表4 移植胚胎数、胚胎质量对受胎率的影响

表5 胚胎移植结果

3.2 本次胚胎移植对供体羊处理采用早晨发情下午配种，下午发情第二天早晨配种的办法，每只羊二次配种，间隔12 h，可能使有些供体羊错过发情时间或发情没有结束就停止了配种，造成部分卵子没有受精。另外，本场杜泊种公羊处于秋季人工授精时期，采精频繁，精液品质有所下降也是造成部分供体母羊没有受精的一重要因素。

3.3 早期胚胎在一定时间内处于游离状态、无排异性等特性是胚胎移植建立的生理基础，但胚胎移植受孕要求供体和受体种属上、生理上、胚胎收集和移植部位必须一致，才使胚胎移植成活成为可能。本次移植受体羊处于秋季正常发情季节，采用两次注射PG 法进行同期发情处理，同期率达84.5%。在同期处理时受体羊比供体羊提前12 h注射PG 同期性好，移植受胎率高。

3.4 羊的鲜胚移植主要环节就是供受体的选择、供受体繁殖营养调控、供受体的同期发情、供体超数排卵(供体打针、胚胎的采集、胚胎的评定)、胚胎的移植、术后保健等。在具体工作中要相互衔接，环环紧扣，技术人员必须有很强的专业理论水平，同时兼有操作技术水平，团队成员之间能够相互协作，带头人要具有强烈的责任心、细心、耐心才能完成。

［1］秦永康，杨民，方依根，等.国内家畜胚胎移植的现状与展望［J］.家畜生态报，2008，29(2):102-106.

［2］郭志勤.家畜胚胎工程［M］.北京:中国科技出版社，1998.

［3］李俊，桑润兹.杜泊羊胚胎试验［J］.畜牧与兽医，2005，37(2):26-27.

［4］毛杨毅，罗惠娣，郭慧慧，等.肉用绵羊胚胎移植技术推广应用效果［J］.中国草食动物科学，2012S1:274-277.

［5］张帆，李晓丽，王俊，等.杜泊绵羊超数排卵及胚胎影响因素分析［J］.黑龙江动物繁殖，2014，22(3):40-44.

［6］张良.不同剂量促卵泡素对母羊冲胚数的影响［J］.黑龙江动物繁殖，2008，16(1):26-27.