均匀与正交设计法优化水飞蓟宾微粒制备工艺的比较研究*

尹雪雁，许凉凉，伊辛，吴晨悦，蔡程科

（北京中医药大学中药学院，北京100102）

均匀与正交设计法优化水飞蓟宾微粒制备工艺的比较研究*

尹雪雁，许凉凉，伊辛，吴晨悦，蔡程科

（北京中医药大学中药学院，北京100102）

［目的］通过快速膜乳化耦合溶剂挥发法制备粒径均一可控的水飞蓟宾微粒，对其制备工艺进行考察，优选最佳制备条件，并对均匀设计法和正交设计法进行比较。［方法］以水飞蓟宾微粒的平均粒径D（0.5）及径距为指标，用均匀设计法和正交设计法对水相浓度、油水相体积比、过膜压力及固化时间等影响因素进行考察。［结果］确定制备工艺为水相浓度3%、油水相体积比1∶2、过膜压力0.6 MPa、固化时间60 min。［结论］该制备工艺简单、快速、稳定、可靠，所得水飞蓟宾微粒粒径均一，均匀设计在水飞蓟宾微粒制备工艺筛选实验中具有很好的可行性。

水飞蓟宾；膜乳化耦合溶剂挥发法；微粒；均匀设计；正交设计

水飞蓟宾由一分子黄杉素和一分子松柏醇耦合而成，具有清除自由基、抗脂质过氧化、保护肝细胞膜、促进被损伤肝细胞合成DNA和结构蛋白以及抗纤维化等药理活性［1-2］；同时，兼有抗炎、降血脂、抗肿瘤等新功效［3-4］，对急慢性肝炎、代谢中毒性肝损伤和肝硬化具有较好的疗效［5］，是世界上公认的肝损伤修复药［1］。目前已有相关的药物上市，如水飞蓟宾胶囊、复方益肝灵等药物［6］。然而，水飞蓟宾的水溶性及脂溶性低，口服吸收差，有较大的首过效应，且体内的半衰期短，生物利用度低，不能达到预期的临床效果，因此，本研究突破常规，采用膜乳化耦合溶剂挥发法制备水飞蓟宾微粒，设法增加水飞蓟宾的溶解度及溶出度，以提高其生物利用度［7］。实验中将药物水飞蓟宾溶于有机溶剂中，聚乙烯醇（PVA）水溶液作为抗溶剂，制备水飞蓟宾微粒。

本研究以水飞蓟宾微粒的平均粒径D（0.5）和径距（span）为考察指标，采用新膜材合金加工的0.5微米级的多级串联膜管，沿用前期的膜乳化耦合溶剂挥发法制备粒径均一的水飞蓟宾微粒，以均匀设计法和正交设计法［8-9］对水飞蓟宾微粒的制备工艺进行考察，优选出最佳制备工艺；在前期研究的基础上，考察更小膜孔径的膜管及增加膜管级数对微粒粒径的影响；以目前已普遍认可的正交设计法为对照，对应用均匀设计法的可行性进行分析。

1　仪器与材料

KH-7200DB型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司），JFC-1600真空离子溅射仪（日本JEOL公司），JEM-6700F冷场发射扫描电子显微镜（日本JEOL公司），马尔文激光粒径测试仪（Mastersizer 2000，英国马尔文仪器有限公司），快速膜乳化器（中国科学院过程工程研究所），不锈钢膜乳化装置（北京中医药大学）。

水飞蓟宾（西安华萃生物技术有限责任公司，批号20111101，纯度＞99%），聚乙烯醇PVA1788（山西三维集团股份有限公司），去离子水（北京中医药大学），氯化钠（北京市化工厂），乙酸乙酯等。

2　水飞蓟宾微粒制备工艺研究

2.1样品制备前期处理在水飞蓟宾微粒的制备前，需经过含药油相、水相的制备等前期处理，以油相浓度0.8%，水相浓度3%，油水相体积比1∶9，制备100 mL预乳液［10］为例制备样品。

制备水相：精密称量3 g聚乙烯醇（PVA1788），边搅拌边加入100 mL常温去离子水，IKA磁力搅拌器进行搅拌（转速档×4，温度档×3），搅拌30 min至无明显颗粒，60℃水浴锅保温，真空抽滤，过膜，待用。

制备含药油相：精密称取水飞蓟宾0.8 g于具塞锥形瓶中，加入100 mL乙酸乙酯［11］有机溶剂，加塞封口，放入60℃水浴锅中溶解至透明澄清，无明显颗粒，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，待用。

2.2快速膜乳化耦合溶剂挥发法制备水飞蓟宾微粒精密称取10 mL含药油相，分散于90 mL水相中，不加成球辅料聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），振荡至均匀混悬，倒入快速膜乳化器［12］中，经氮气加压，从出液口收集滤液，过膜3次，加入1倍量3%PVA溶液作固化液，磁力搅拌，固化1.5h，离心清洗4次（PVA基本被清除），生理盐水复溶后，收集沉淀物，冷冻干燥制成冻干粉。

2.3评价指标

2.3.1微粒的粒径将一定量的冻干微粒在一定量的生理盐水中分散，采用马尔文激光粒径测试仪测定粒径分布。本实验采用平均粒径D（0.5）值为评价指标之一，D（0.5）越小粒径越小［13-14］。

③对试验路段进行试铺，确定摊铺机的摊铺速度、摊铺宽度、摊铺温度、自动找平方式等摊铺步骤；压路机碾压温度、碾压速度、碾压次数等压实步骤以及松铺系数。

2.3.2微粒的径距同样使用马尔文粒径测试仪可以检测出微粒的径距（span）。径距代表微粒粒径的跨越范围，span值越小说明微粒分布越均一。平均粒径及径距可由下图1得出。

图1　水飞蓟宾微粒粒径分布图Fig.1　The distribution diagram of silybin particles size

2.3.3微粒的电镜特征导电胶布粘在样品台上，取少量水飞蓟宾微粒均匀平铺于导电胶布上，并用吸耳球吹走多余粉末，抽真空，采用离子溅射仪对样品喷金（20 mA，120 s）后，将样品台置于扫描电镜样品室中，抽真空，观察微粒形貌［13-14］。图2中（1）和（2）分别为微粒放大5 000倍和10 000倍下微粒的电镜图。

图2　水飞蓟宾微粒扫描电镜图Fig.2　The scanning electron microscope figure of silybin particles

3　水飞蓟宾微粒常规制备的工艺参数

快速膜乳化耦合溶剂挥发法制备水飞蓟宾微粒的步骤主要包括预乳液的制备、乳液加压过膜、溶剂挥发、固化清洗、微粒收集、冷冻干燥等环节，整个制备过程中存在很多影响微粒表征的因素。前期课题组已对实验过程中膜管孔径大小、油相浓度、水相浓度、油水相体积比、过膜压力、预乳液与固化PVA溶液体积比［15-17］，以D（0.5）、span为指标进行了初步考察。常规因素水平：水相浓度、油相浓度、油水相体积比、固化液种类、过膜压力、膜孔径等，详细说明见表1。

表1　常规因素水平表Tab.1　Factors of the conventional level table

4　均匀设计法及正交设计法优化水飞蓟宾微粒制备工艺的比较

4.1均匀设计实验结合课题组前期单因素考察结果，筛选出对微粒制备影响较大的因素，通过均匀设计实验进行工艺优化。以D（0.5）及span综合的校正参数作为评价指标，校正参数愈小，结果愈好。根据U9（95）（D=0.406 6）的均匀设计使用表，将水相浓度、油水比、过膜压力、固化时间分别安排在表的1、2、3、5列（D=0.406 6），均匀设计实验水相浓度、油水相体积比、过膜压力及固化时间各因素水平详见表2，均匀设计实验方案安排及结果详见表3（n=2）。

均匀设计实验相关性由SPSS17.0分析所得，分析结果详见表4。

表2　因素水平表Tab.2　Factor level table

表3　均匀实验设计方案与结果Tab.3　Scheme and results of uniform design

表4　均匀设计相关系数分析结果（n=18）Tab.4　Analysis results of correlation coefficient（n=18）

由表4 SPSS17.0相关性分析结果可知，校正参数与油水比、过膜压力两因素的显著性系数（P值）分别为0.020、0.000，两者均小于0.05，说明校正参数与油水比、过膜压力两因素相关；油水比、过膜压力两因素的Spearman相关系数的绝对值分别为0.489、0.867，说明过膜压力与校正参数的相关性较好，且油水比、过膜压力两因素与校正参数均呈负相关。综上，均匀设计工艺优化的结果是油水比2∶3，压力0.75 MPa。

4.2正交设计实验同4.1均匀实验设计考察因素一致，通过正交设计实验进行工艺优化。以D（0.5）及span两者综合的校正参数作为评价指标，校正参数数值愈小愈好。根据L9（34）的正交表，将上述四因素分别安排在表的1、2、3、4列，正交设计实验因素水平安排详见表5，正交设计实验方案及结果详见表6（n=2）。

4.2.1结果分析

表5　因素水平表Tab.5　Factor level table

表6　正交设计表Tab.6　Orthogonal design table

表7　正交实验直观分析结果Tab.7　The results of orthogonal design-direct analysis

通过直观分析可得出影响微粒的因素由大到小为：过膜压力（C）＞水相浓度（A）＞油水比（B）＞固化时间（D），最佳实验条件参数为C2A0B2D2。

4.2.1.2方差及相关性分析根据表6正交实验设计与结果中数据进行方差分析，具体结果详见表8。

由表8方差分析结果知，因素A、B、C、D的P值均小于0.05，均有统计学意义，说明因素A、B、C、D对微粒的表征均有影响。结合表9相关性分析结果可知，因素A、C的P值分别为0.021、0.001，两者均小于0.05，均有统计学意义，说明因素A、C相对地与微粒表征的相关性较大；因素A、C的Spearman相关系数的绝对值分别为0.485、0.682，说明因素C较因素A与微粒的相关性较大，最佳实验条件参数为C2A0。结合实际条件，由表10过膜压力与固化时间均值表可知，因素C在1、2水平C1、C2时均值相当，为节省氮气资源，优先考虑使用过膜压力0.6MPa；因素D在0、2水平C0、C2时均值相当，为提高制备效率，优先考虑使用固化时间60 min，综上，正交设计实验的最佳工艺参数条件为C1A0B2D0，即水相浓度为3%，油水比为1∶2，过膜压力为0.6 MPa，固化时间为60 min。

表8　正交实验方差分析结果Tab.8　The results of analysis of variance

表9　正交设计相关系数分析结果（n=18）Tab.9　Analysis results of correlation coefficient（n=18）

表10　过膜压力与固化时间均值Tab.1　0Mean of pressure through membrane and curing time

5　讨论

快速膜乳化耦合溶剂挥发法制备水飞蓟宾微粒的基本原理是把研究药物溶解于有机溶剂中形成溶液，选择另一种不能溶解药物及有机溶剂的溶液作为抗溶剂，通过超声或振荡等方法将有机溶剂扩散到抗溶剂中，形成乳液，乳液经加压通过多孔过滤膜管，有机溶剂被挤压成微小液滴，分散在抗溶剂中，随着有机溶剂的挥发，药物微粒析出并悬浮于抗溶剂中，离心洗涤，收集微粒，即得水飞蓟宾微粒。快速膜乳化法制备工艺简单、无需加热、成本低，制得的微粒粒径较小且均匀，本实验为水飞蓟宾的合理研究开发和有效利用提供了新的研究思路，提升了水飞蓟宾的应用价值。

由课题组前期的单因素实验考察结果可知，随着过膜压力增加，微粒D（0.5）及span呈减小的趋势。均匀设计结果也表明，过膜压力最大值0.75 MPa为优化条件，与单因素考察结果相符。分析过膜压力对微粒的影响受液滴黏度、液滴表面张力、膜管孔径大小及堵塞程度等众多因素影响。均匀设计中膜管清洗充分，乳液用量较少，但多级小孔径新膜管的串联使乳液过膜的分级压力逐级递减，较大的外界压力才能使乳液顺畅流出。将均匀设计实验与正交设计实验的结果进行分析比较后可知：在理论最佳制备条件方面，对过膜压力和油水相体积比的结论是一致的，但考虑到实际制备条件，并且为了节省氮气资源，提高制备效率，对于新合金多级膜管的水飞蓟宾微粒的制备，优选过膜压力0.6 MPa，油水相体积比1:2，水相浓度3%，固化时间60 min。

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（本文编辑：高杉，马英）

Comparative study on optimization of silybin particles preparation by uniform design and orthogonal design

YIN Xue-yan，XV Liang-liang，YI Xin，WU Chen-yue，CAI Cheng-ke
（School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

［Objective］To prepare silybin micro-particles by premix membrane emulsification coupling solvent evaporation，investigate its preparation procedure，optimize the preparation conditions by the uniform design and orthogonal design，respectively，and compare the two experiment design methods in terms of their feasibility.［Methods］With the average diameter of particle D（0.5）and span as criteria，the uniform design and orthogonal design were used，respectively，to examine the influence of such factors，as the aqueous phase concentration，volume ratio of oil phase to water，pressure through membrane and curing time，on the preparation procedure.［Results］It was found that the optimized preparation procedure was the aqueous phase concentration 3%，volume ratio of oil phase to water 1:2，pressure through membrane 0.6 MPa and the curing time for 60 min.［Conclusion］The preparation procedure is simple，fast，stable and reliable. The average diameter of particle of the silybin micro-particles is uniform.The uniform design shows a higher feasibility in the present screening test on the preparation procedure of the silybin micro-particles.

silybin；premix membrane emulsification coupling solvent evaporation；micro-particle；uniform design；orthogonal design

R283

A

1672-1519（2015）12-0752-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.12.13

国家自然科学基金资助项目（81173562）。

尹雪雁（1989-），女，硕士在读，从事中药新剂型与新制剂研究。

蔡程科，E-mail:cck98@126.com。

（2015-06-29）