UPLC-Q-TOF/MS法鉴定大鼠体内甘草素的代谢产物*

李元元，江振作，张蕾，柴欣，王跃飞

（1.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室，天津300193；2.天津国际生物医药联合研究院，中药新药研发中心，天津300457）

UPLC-Q-TOF/MS法鉴定大鼠体内甘草素的代谢产物*

李元元1，2，江振作1，2，张蕾1，2，柴欣1，2，王跃飞1，2

（1.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室，天津300193；2.天津国际生物医药联合研究院，中药新药研发中心，天津300457）

［目的］研究甘草素在大鼠体内的代谢产物。［方法］采用静脉注射（iv）、灌胃（ig）两种给药方式，剂量20 mg/kg，收集大鼠血浆、尿液、粪便、胆汁，应用UPLC-Q-TOF/MS法鉴定甘草素的代谢产物。［结果］血浆、尿液、粪便、胆汁样品中共鉴定15种代谢产物，主要有异甘草素、（异）甘草素葡萄糖醛酸结合物和硫酸结合物、二氢异甘草素、二氢异甘草素硫酸结合物、异甘草素甲基化及甘草素脱氢的代谢产物；其主要代谢途径为异构化、葡萄糖醛酸化、硫酸化、甲基化、脱氢反应。［结论］构建的UPLC-Q-TOF/MS法可用于大鼠体内甘草素代谢产物的研究。

甘草素；代谢产物；UPLC-Q-TOF/MS；异构化；葡萄糖醛酸化；硫酸化

甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根茎；性味甘平，归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳等功效［1］。甘草素是甘草黄酮的代表性成分，具有抗炎、抑制急性肝损伤、抗肿瘤等作用［2-4］。甘草素的活性及药效与其体内代谢过程密切相关。为进一步研究甘草素体内代谢特征，分离制备甘草素体内代谢产物，本实验采用静脉注射（iv）、灌胃（ig）两种给药方式，应用UPLC-Q-TOF/MS法鉴定大鼠给药后血浆、尿液、粪便、胆汁样品中的代谢产物，共鉴定15种代谢产物。为甘草素代谢产物的制备，同时也为甘草中其他黄酮类成分代谢研究提供有益借鉴。

1　材料

1.1仪器ACQUITYTMUPLC-Xevo G2-S液质联用仪（美国Waters公司，MassLynx V4.1色谱工作站）；十万分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，型号：XS205）；涡旋混合仪（德国IKA公司，型号：VORTEX GENIUS3）；真空离心浓缩仪（德国Eppendorf公司，型号：Concentrator plus）；高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂，型号：TGL-16C）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，型号：RE-2000）；超声波清洗器（天津市恒奥科技发展有限公司，型号：HS615OD）；大鼠代谢笼（意大利TECNIPLAST公司）。

1.2试药甘草素（成都普菲德生物技术有限公司，批号：131102）；乙腈、甲醇（SIGMA-ALDRICH公司，色谱纯）；甲酸（天津市大茂化学试剂厂，色谱纯）；聚乙二醇400、D101大孔吸附树脂、95%乙醇（天津市大茂化学试剂厂，分析纯）；氯化钠注射液（河北天成药业股份有限公司）；超纯水（实验室自制，Milli-Q纯水系统）。

1.3动物SD大鼠，雌性，体质量200～220 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2009-0004。动物实验伦理审批号：TJABTJU20140003。

2　方法

2.1甘草素溶液配制取甘草素适量，精密称定，溶于聚乙二醇400-生理盐水（4∶6，v/v）溶液，制成每毫升含5 mg的甘草素溶液［5］。

2.2生物样品采集

2.2.1血浆采集取健康SD大鼠6只，随机分为2组，每组3只，给药前禁食12h，分别iv、ig（20 mg/kg）给药，肝素抗凝，目眦取血。iv组：2、5、10、15、30、45、60、120、240、360、480、600 min；ig组：15、30、60、90、120、240、360、480、600、720 min，-80℃保存。样品处理前，等量混合各时间点血浆［6］，备用。

2.2.2尿液、粪便、胆汁采集另取6只健康SD大鼠，随机分为2组，每组3只，置于代谢笼中，分别iv、ig（20 mg/kg）给药，收集给药前、给药后0～24 h尿液、粪便，-80℃保存。大鼠饲养3 d后采集胆汁，给药前禁食12 h，分别iv、ig（20 mg/kg）给药，大鼠腹腔注射20%乌拉坦麻醉，插管引流胆汁，收集0～24 h胆汁，-80℃保存。

2.3生物样品处理

2.3.1血浆样品处理取血浆1.2 mL，加甲酸酸化后（终浓度1%），加入3倍量甲醇，涡旋，14 000 r/min离心10 min。取上清液3.6 mL离心浓缩，加入200 μL 30%甲醇水溶液复溶，涡旋，14 000 r/min离心10 min。取上清液，用30%甲醇水溶液稀释5倍，即得。

2.3.2尿液样品处理取尿液3.5 mL，4 000 r/min离心10 min，取上清液3 mL，加甲酸酸化（终浓度1%），D101大孔吸附树脂纯化，依次用0.1%甲酸水溶液、95%乙醇洗脱［7-8］，收集95%乙醇洗脱液，浓缩，加入200 μL 10%甲醇水溶液复溶，涡旋，14 000 r/min离心10 min。取上清液，用10%甲醇水溶液稀释100倍，即得。

2.3.3粪便样品处理取粪便1 g，精密称定，碾碎，加入10倍量50%甲醇水溶液，超声提取30 min，4 000 r/min离心10 min。取上清液9 mL，减压浓缩，10 mL蒸馏水复溶，加甲酸酸化（终浓度1%），D101大孔吸附树脂纯化，依次用0.1%甲酸水溶液、95%乙醇洗脱。收集95%乙醇洗脱液，浓缩，加入200 μL 30%甲醇复溶，涡旋混匀，14 000 r/min离心10 min。取上清液，用30%甲醇水溶液稀释200倍，即得。

2.3.4胆汁样品处理取适量胆汁样品，4 000 r/min离心10 min，取上清液2 mL，用0.1%甲酸水溶液稀释1倍后加甲酸酸化（终浓度1%），D101大孔吸附树脂纯化，依次用0.1%甲酸水溶液、95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液，浓缩，加入200 μL 30%甲醇水溶液复溶，涡旋，14 000 r/min离心10 min。取上清液，用30%甲醇水溶液稀释1 000倍，即得。

2.4分析方法的建立

2.4.1色谱条件色谱柱：ACQUIFY UPLC BEH C18（100×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～10 min，5%～35%B；10～15min，35%～95%B；15～17min，95%B；17～17.5 min，95%～5%B；17.5～20 min，5%B；流速：0.4 mL/min；柱温：40℃；进样量：10 μL。

2.4.2质谱条件ESI电喷雾离子源，负离子检测模式；毛细管电压-2 kV；锥孔电压30 V；离子源温度100℃；脱溶剂气温度400℃；锥孔气流量50 L/h；脱溶剂气流量800 L/h；碰撞能量10～60 V；扫描范围m/z 100～1 200；数据采集模式：MSE；数据分析：质量亏损过滤（MDF）。

3　结果

3.1大鼠血浆、尿液、粪便、胆汁样品UPLC-QTOF/MS分析大鼠血浆、尿液、粪便、胆汁样品经UPLC色谱分离，采用MSE扫描模式采集质谱数据，运用Metabolynx软件检索代谢产物。通过代谢产物的准分子离子、特征碎片离子推测代谢产物［9-10］。本实验采用iv和ig给药方式，经分析在大鼠体内共检测到15个代谢产物。大鼠空白及给药后血浆、尿液、粪便、胆汁样品中代谢产物的负离子提取离子流色谱图，如图1所示。甘草素代谢产物质谱鉴定结果见表1。

3.2大鼠体内甘草素代谢产物结构解析甘草素是甘草黄酮的代表性成分，在大鼠体内发生广泛代谢，其主要代谢途径有：异构化、甲基化、脱氢反应、葡萄糖醛酸化、硫酸化。负离子模式下，甘草素及其代谢产物易发生RDA裂解，产生特征性的碎片离子［11-12］。以甘草素为例，甘草素准分子离子为m/z 255.065 8，二级碎片离子m/z 135.008 7，119.050 2，其质谱裂解方式如下所示：

根据不同代谢途径，对大鼠体内代谢产物进行结构解析。

异构化反应（M13、M14）：相关文献报道［13］：大鼠给药甘草素、甘草苷后在体内转化成异甘草素和二氢异甘草素。代谢物M13的保留时间为9.95 min，准分子离子m/z 257.081 4，二级碎片离子为m/z 151，与文献报道的二氢异甘草素质谱信息一致，推测M13可能为二氢异甘草素。代谢物M14保留时间为10.29 min，碎片离子与甘草素相同，推测M14可能为异甘草素。

甲基化反应（M15）：代谢物M15的保留时间为10.94 min，准分子离子m/z 269.081 5，M15的质量数比（异）甘草素多14，推测可能发生甲基化反应。根据甘草素与异甘草素的色谱保留行为，推测M15可能为异甘草素甲基化的代谢产物。结合碎片离子m/z135，可推测甲基取代位点为异甘草素B环4′位羟基。

图1　大鼠空白及给药后血浆、尿液、粪便、胆汁提取离子流色谱图Fig.1　The extracted ion chromatogram of blank and administrated plasma，urine，feces and bile in rats

脱氢反应（M6）：代谢物M6保留时间为6.87 min，准分子离子m/z 253.050 9，推测M6可能为（异）甘草素脱去2H的代谢产物，碎片离子m/z 209、135、117，结合文献报道［14］，推测M6的脱氢反应可能发生在甘草素C环C2-C3。

葡萄糖醛酸结合反应（M1、M2、M3、M7、M8）：代谢物M1的保留时间为3.24 min，准分子离子m/z 607.128 8，质量数比（异）甘草素多352，推测可能结合2个葡萄糖醛酸。碎片离子m/z 431、255、175、135、119，其中m/z 255、135、119与（异）甘草素的特征碎片离子相同，根据甘草素与异甘草素的色谱保留行为，推测M1可能为甘草素二葡萄糖醛酸结合物。代谢物M2的保留时间为4.95 min，准分子离子m/z 431.0982，质量数比（异）甘草素多176，碎片离子m/z 255、175、135、119，根据甘草素与异甘草素的色谱保留行为，推测M2可能为甘草素葡萄糖醛酸结合物。代谢物M3、M7、M8的一、二级质谱信息与代谢物M2的一致，因此，可根据甘草素与异甘草素的色谱保留行为，推测代谢物M3可能为甘草素葡萄糖醛酸结合物，M7、M8可能为异甘草素葡萄糖醛酸结合物，具体信息见表1。

表1　甘草素代谢产物质谱鉴定结果Tab.1　The characterization of metabolites of liquiritigenin by mass spectrometry

硫酸结合反应（M4、M5、M9、M10、M11、M12）：代谢物M4的保留时间为5.79 min，准分子离子m/z 335.0224，质量数比（异）甘草素多80，碎片离子m/z 255、135、119，根据甘草素与异甘草素的色谱保留行为，推测M4可能为甘草素硫酸结合物。代谢物M5、M10、M12的一、二级质谱信息与代谢物M4的一致，因此，可根据甘草素与异甘草素的色谱保留行为，推测代谢物M5可能为甘草素硫酸结合物，M10、M12可能为异甘草素硫酸结合物。代谢物M9的保留时间为7.91 min，准分子离子m/z 337.0781，碎片离子m/z 257、151与二氢异甘草素的碎片离子相同，推测M9可能为二氢异甘草素硫酸结合物。代谢物M11的一、二级质谱信息与代谢物M9的一致，因此推测代谢物M11可能为二氢异甘草素硫酸结合物，具体信息见表1。

根据以上信息，推测甘草素代谢途径如图2所示。

4　讨论

为了减少生物样品中的基质对质谱检测结果的影响，在样品分析前需进行纯化处理，如：尿液中含有大量的水分、无机盐及含氮物质，胆汁中含有大量的胆汁酸和无机盐［15］，粪便中含有大量的食物残渣，可采用大孔树脂进行预处理，使用0.1%甲酸水溶液洗脱，对样品进行脱盐、除杂处理；血浆中富含各种蛋白质会严重干扰质谱检测结果，本研究采用甲醇沉淀蛋白法去除。此外，高分辨质谱的准确度与化合物的浓度息息相关，化合物的浓度过高或过低均会导致检测结果偏差较大。因此，为了准确分析各生物样品中的代谢产物，本研究先将上述纯化后样品浓缩，再根据不同生物样品中代谢产物在质谱仪中的信号强度，调整各样品的浓度，以保证所有生物样品中的代谢产物能被质谱准确检测。

图2　大鼠体内甘草素可能代谢途径Fig.2　The proposed metabolic pathway of liquiritigenin in rats

药物进入机体，经机体处置，最终随尿液、粪便、汗液、乳汁等排出体外。其中尿液和粪便是药物的主要排泄形式，药物通过Ⅰ相、Ⅱ相代谢，改变、增加药物的极性，其中极性较大的化合物随血液流经肾脏，经肾小球滤过，以主动或被动形式随尿液排出体外；极性较小的化合物经肝脏代谢和胆盐一起排入肠道，最终以粪便的形式排出体外。本研究结果：大鼠血浆主要检测到（异）甘草素葡萄糖醛酸结合物和硫酸结合物等；尿液检测到（异）甘草素葡萄糖醛酸结合物和硫酸结合物、异甘草素等；粪便主要检测到原型药物、二氢异甘草素及少量的（异）甘草素硫酸结合物等；胆汁中主要为原型药物及少量的甘草素葡萄糖醛酸结合物。由结果可知，不同生物样品中药物代谢产物类型差异较大，Ⅰ相代谢产物主要存在粪便中，Ⅱ相代谢产物主要存在于血浆、尿液中；此外，为系统研究药物的代谢轮廓，阐明药效物质基础，需同时研究药物在血浆、尿液、胆汁和粪便中的代谢产物。

5　结论

甘草素体内主要代谢部位是肝脏，甘草素经肠粘膜吸收后，在肝药酶的作用下发生Ⅰ相、Ⅱ相代谢反应［16-17］。甘草素在大鼠体内进行广泛代谢，主要发生了异构化、甲基化、脱氢、葡萄糖醛酸结合、硫酸结合反应。

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（本文编辑：高杉，马英）

Characterization of metabolites of liquirtigenin in rats by UPLC-Q-TOF/MS

LI Yuan-yuan1，2，JIANG Zhen-zuo1，2，ZHANG Lei1，2，CHAI Xin1，2，WANG Yue-fei1，2
（1.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine，Research and Development Center of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300457，China）

［Objective］To systemically study metabolites of liquirtigenin in rats，an UPLC-Q-TOF/MS method was developed.［Methods］UPLC-Q-TOF/MS method was employed to identify metabolites of liquirtigenin in plasma，urine，feces and bile samples from rats after iv and ig administration of liquirtigenin（20 mg/kg）.［Results］A total of 15 metabolites were characterized in those biological samples，including isoliquirtigenin，glucuronides and sulfates of（iso）liquirtigenin，davidigenin and its sulfates，methylated isoliquirtigenin，dehydrogenated liquirtigenin.The main metabolic pathways of liquirtigenin were isomerization，glucuronidation and sulfation，methylation，dehydrogenation.［Conclusion］The UPLC-Q-TOF/MS method established in this study is successfully applied to identify metabolites of liquirtigenin in rats.

liquirtigenin；metabolite；UPLC-Q-TOF/MS；isomerization；glucuronidation；sulfation

R284

A

1672-1519（2015）12-0757-06

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.12.14

国家自然科学基金资助项目（81202877）。

李元元（1988-），女，硕士在读，主要研究方向中药质量控制。

王跃飞，E-mail:wangyuefei_2006@hotmail.com。

（2015-07-03）