栀翘生肌软膏无菌检查方法学探讨

田翠　林小晖　郑鹏（济南市食品药品检验检测中心，山东济南 250001）

栀翘生肌软膏无菌检查方法学探讨

田翠林小晖郑鹏
（济南市食品药品检验检测中心，山东济南 250001）

目的：建立栀翘生肌软膏的无菌检查方法。方法：按照《中国药典》2010年版附录的要求，采用薄膜过滤法进行无菌检查，冲洗液用量为每筒300ml，通过接种6株阳性菌进行方法学验证。结果：6株阳性菌在试验组与阳性对照组均生长良好。结论：本法可消除栀翘生肌软膏的抑菌作用，适用于该制剂的无菌检查。

栀翘生肌软膏 无菌检查 方法学验证

栀翘生肌软膏具有清热解毒、活血化瘀、去腐生肌的作用，适用于烧伤、烫伤、溃疡、褥疮、痔疮及手足干裂，其对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抑菌作用。根据《中国药典》要求［1］，栀翘生肌软膏应进行无菌检查并建立无菌检查方法验证。本文按照《中国药典》要求，采用薄膜过滤法进行无菌检查方法验证［2］，建立栀翘生肌软膏的无菌检查标准方法。

1　试验材料与仪器

（1）供试品：栀翘生肌软膏，批号130526，济南市卫生科技交流服务中心。

（2）培养基：营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、硫乙醇酸盐流体培养基，pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液，均购自北京三药科技开发公司； 0.9%无菌氯化钠溶液按《中国药典》2010年版附录中有关规定进行配置、分装和灭菌。

（3）验证实验用菌种（第4代））：大肠埃希菌［CMCC（B）44 102］、金黄色葡萄球菌 ［CMCC（B）26 0003］、枯草芽孢杆菌 ［CMCC（B）63 501］、生孢梭菌 ［CMCC（B）64 941］、白色念珠菌［CMCC（F）98 001］、黑曲霉 ［CMCC（F）98 003］，均购自中国食品药品检定研究院。

（4）仪器：高压蒸汽灭菌器，电子天平，生物安全柜，无菌检测隔离器，集菌培养器，生化培养箱。

2　方法

（1）菌液的制备：取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、大肠埃希菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，30～35℃培养24小时，取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，23～28℃培养24小时。上述培养物用0.9%的无菌氯化钠溶液制成小于100cfu/ml的菌悬液，计数，备用；另将黑曲霉孢子悬液用0.9%无菌氯化钠溶液制成小于100cfu/ml，计数，备用。

表1　无菌检查方法的验证结果

（2）供试液制备：取栀翘生肌软膏10盒，每盒以无菌操作方式称取1g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯的容器中，充分振摇使供试品溶解，然后加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液200ml，振摇5～10分钟，萃取，静置，使油水明显分层，取其水层作为供试液。

（3）方法验证试验组：取“2.2”项下供试液按薄膜过滤法过滤至集菌培养器中，每个滤筒用300ml pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液分三次冲洗滤膜，冲洗后加相应培养基100ml，然后分别加入小于100cfu/ml的相应菌液至滤筒，硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养，改良马丁培养基置23～28℃培养，逐日观察其结果。

（4）方法验证阳性对照组：不加供试品，直接用pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液，冲洗程序和冲洗量、加培养基、加阳性菌均与“2.3方法验证试验组”项下方法相同。与试验组在相同条件下培养，并逐日观察其结果。

（5）供试品的无菌检查：取“2.2”项下供试液按薄膜过滤法过滤至集菌培养器中，每个滤筒用300ml pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液分三次冲洗滤膜，冲洗后加相应培养基100ml，阳性组加入金黄色葡萄球菌作为对照，在相应培养条件下培养，逐日观察其结果。

（6）阴性对照组：取冲洗液按薄膜过滤法过滤，冲洗后每个滤筒中加入相应培养基100ml，在相应培养条件下培养，逐日观察其结果。

3　结果与分析

3.1无菌检查方法的验证

按照文中验证的冲洗量和冲洗方法操作，其结果显示试验组和阳性对照组培养基均在48h内变浑浊，且2组之间在培养时间方面无显著差异，表明栀翘生肌软膏在该条件下无抑菌活性或抑菌活性可以忽略不计。无菌检查方法验证情况，见表1。

3.2供试品的无菌检查

按“3.2无菌检查方法的验证”项下的验证方法，用薄膜过滤法对样品做无菌检查发现：阳性对照组培养基在24h内变浑浊，培养14d后，阴性对照组和供试品组均无菌生长，培养基澄清。供试品无菌检查经培养14d后的情况，见表2。

表2　供试品无菌检查结果

4　讨论

（1）栀翘生肌软膏处方中含有麻油等脂溶性成分，采用十四烷酸异丙脂作为分散剂，增大它的溶解性，使其充分分散溶解。（2）栀翘生肌软膏含有抑菌成分，与其他品种烫伤膏类似［3］，故未采用直种法进行方法学验证，而采用薄膜过滤法，消除供试品中的抑菌成分后再进行无菌检查。（3）栀翘生肌软膏系列验证试验表明： 样品试验组、阳性对照组中各试验菌均能在 48h 内生长良好。说明在此实验条件下所采用的该方法适合于栀翘生肌软膏的无菌检查。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.中国医药科技出版社，2010，附录XⅢ B：76-79.

［2］中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范［M］.中国医药科技出版社，2010：337-351.

［3］陈引秀，朱铮.复方雪莲烧伤膏无菌检查法方法学探讨，海峡药学，2007，19（9）：45-4.