补肾中药有效成分对SAMP8小鼠氧化应激水平的影响*

王占奎，周　震，张琳琳，刘　爽，宋婉珊，郭家奎，张玉莲

·中药研究·

补肾中药有效成分对SAMP8小鼠氧化应激水平的影响*

王占奎，周震，张琳琳，刘爽，宋婉珊，郭家奎，张玉莲

（天津中医药大学第二附属医院针灸脑病中心，天津300150）

［目的］观察补肾中药有效成分补骨脂素、齐墩果酸、淫羊藿苷对快速老化（SAMP8）小鼠氧化应激水平的影响。［方法］选取9月龄雄性SMAP8小鼠，采用随机数字表法随机分为补骨脂素组、齐墩果酸组、淫羊藿苷组及模型组。同时另取同龄段的抗快速衰老亚系1（SAMR1）小鼠作为对照组。治疗组分别给予补骨脂素（50mg/kg）、齐墩果酸（50mg/kg）、淫羊藿苷（20mg/kg）灌胃，对照组与模型组均给予等量的生理盐水灌胃，每次0.3mL，每日1次，连续灌胃4周后断头取脑。采用酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测SMAP8小鼠大脑皮质中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的含量。［结果］SMAP8小鼠大脑皮质中SOD、CAT和GSH-Px活性较同龄SAMR1小鼠明显降低，模型组大脑皮质SOD、CAT和GSH-Px活性均低于对照组，经4周治疗后，治疗组大脑皮质中SOD、CAT和GSH-Px活性均高于模型组，对于以上指标，补骨脂素、齐墩果酸、淫羊藿苷3种组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。［结论］补肾中药对SAMP8的氧化应激损伤具有一定保护作用，从而可以达到防治老年性痴呆的作用。

补肾中药；老年性痴呆；补骨脂素；齐墩果酸；淫羊藿苷；氧化应激；SAMP8小鼠

氧化应激（OS）是由自由基在体内产生的一种负面作用，被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。大脑神经元的膜结构是由高浓度的不饱和脂肪酸组成，由于神经元的谷胱甘肽含量较少，只含有中等量抗氧化酶，所以极易被氧化，且清除自由基的能力相对较弱［1］，对氧化应激也特别敏感［2］。氧化应激是阿尔茨海默症（AD）发病的重要假说之一，与AD有着密切关系，如果体内氧化还原平衡遭到破坏，多余的氧自由基会对身体造成氧化损伤，而这种氧化损伤直接参与了AD等多种神经退行性疾病的病理过程［3］。

快速老化（SAMP8）小鼠在幼年时就出现较高的氧化应激水平，脑中脂质过氧化物和过氧化氢产生增加，活性氧高度敏感谷氨酰胺合酶的活性降低，而给予抗氧化剂后，可使其记忆障碍得到明显改善［4-5］。补肾中药防治老年性痴呆有着重要的作用［6-7］。因此，本研究利用补肾中药这一天然的抗氧化剂，观察补肾中药补骨脂、女贞子和淫羊藿的有效成分补骨脂素、齐墩果酸、淫羊藿苷对SAMP8小鼠谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的影响，探讨其调整抗氧化应激系统功能紊乱可能的作用机制，为补肾中药防治老年性痴呆提供实验依据。

1　材料和方法

1.1动物及分组选择40只9月龄健康SAMP8小鼠，雄性，体质量（30±2）g，小鼠购自天津市针灸研究所老化鼠繁育中心。采用随机数字表法随机分为补骨脂素组、淫羊藿苷组、齐墩果酸组及模型组4组，每组10只小鼠。另取10只同龄段的抗快速衰老亚系1（SAMR1）小鼠作为对照组。所有小鼠饲养于SPF动物房。进食方式为自由进食，每周更换鼠笼1次。

1.2药物配制和干预将补骨脂素、齐墩果酸、淫羊藿苷单体用研钵研磨后，混悬于生理盐水中，制成5 g/L补骨脂素悬液、5 g/L齐墩果酸和2 g/L淫羊藿苷悬液，其浓度为补骨脂素50mg/kg，齐墩果酸50mg/kg，淫羊藿苷20mg/kg，治疗组分别给予补骨脂素、齐墩果酸、淫羊藿苷灌胃治疗，连续灌胃4周，每次0.3mL，每日1次。对照组与模型组均用等体积0.9%氯化钠注射液灌胃。

1.3仪器和试剂Infinite 200PRO酶标仪（Tecan Austria GmbH），台式冷冻离心机（德国Universal 16R），1/10000电子分析天平（瑞士Mettler AE100）。SOD、GSH-Px、CAT活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4组织标本提取连续灌胃4周后，小鼠颈椎脱臼处死，于冰台上迅速剥离大脑组织，4℃预冷的生理盐水漂洗，滤纸吸干多余水分后置于电子天平上称质量，按1∶9（质量/体积）加入冰冷生理盐水，用高速分散匀质机制成10%的脑匀浆，取上清液，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）法测定GSH-Px、SOD、CAT活性水平，严格按照试剂盒操作说明进行各指标测定。

1.5统计学方法采用SPSS18.0统计分析软件进行处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计量资料先进行正态分布检验，符合正态分布者，多组组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较时，若方差齐，采用LSD法，若方差不齐，则采用Dunnett’s T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

SMAP8小鼠大脑皮质中的 SOD、CAT和GSH-Px活性较同龄SAMR1小鼠明显降低，说明SMAP8小鼠在9月龄就出现较高的氧化应激水平，与同龄SAMR1小鼠相比，模型组SOD、CAT和GSH-Px活性均低于对照组，说明模型组SOD、CAT和GSH-Px协同清除能力的下降加剧了氧化应激损伤，导致抗氧化防御体系全面下降。经4周治疗后，治疗组SOD、CAT和GSH-Px活性较模型组显著升高，对于以上指标，补骨脂素、齐墩果酸、淫羊藿苷3组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明补骨脂素、齐墩果酸、淫羊藿苷3种补肾中药对SAMP8小鼠的氧化应激损伤具有很好的拮抗作用。见表1-3。

表1　各组小鼠脑组织SOD活性比较（±s）Tab.1　Com parison of SOD activity in brain tissue ofm ice ofeach group（±s）nU/mg

表1　各组小鼠脑组织SOD活性比较（±s）Tab.1　Com parison of SOD activity in brain tissue ofm ice ofeach group（±s）nU/mg

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别　n　SOD模型组　10　18.45±1.55*对照组　10　27.95±1.68#淫羊藿苷组　10　24.04±1.98#补骨脂素组　10　23.94±1.87#齐墩果酸组　10　23.63±2.15#

表2　各组小鼠脑组织GSH-Px活性比较（±s）Tab.2　Com parison ofGSH-Px activity in brain tissueof m ice of each group（±s）U/mg

表2　各组小鼠脑组织GSH-Px活性比较（±s）Tab.2　Com parison ofGSH-Px activity in brain tissueof m ice of each group（±s）U/mg

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别　n　GSH-Px模型组　10　1.44±0.13*对照组　10　1.93±0.10#淫羊藿苷组　10　1.79±0.23#补骨脂素组　10　1.81±0.13#齐墩果酸组　10　1.83±0.12#

表3　各组小鼠脑组织CAT活性比较（±s）Tab.3　Comparison of CAT activity in brain tissueofm ice of each group（±s）U/mg

表3　各组小鼠脑组织CAT活性比较（±s）Tab.3　Comparison of CAT activity in brain tissueofm ice of each group（±s）U/mg

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别　n　CAT模型组　10　05.39±0.65*对照组　10　11.17±0.95#淫羊藿苷组　10　09.86±0.88*#补骨脂素组　10　10.80±1.32#齐墩果酸组　10　09.64±1.13#

3　讨论

SAMP8小鼠具备均一的遗传背景和稳定老化病态特征，在早期就出现Aβ异常沉积、tau蛋白磷酸化、学习记忆功能障碍、神经递质改变、突触结构和功能障碍等多方面的特征性改变，在成熟期（4～6个月）过后发生了快速老化，其快速老化自然产生，与临床痴呆的渐进性发生极为相似，是目前研究衰老和老年性痴呆的较为理想的动物模型［8-9］。

采用“补肾生精”法治疗“痴呆”、“善忘”这类疾病，在延缓和控制疾病的发展上有一定的疗效［7］。中草药或植物提取物来源广泛、效果明显、毒副作用低，并且含有丰富的活性多糖成分，在抗氧化、抗衰老等方面有着重要作用。研究表明，补肾中药有效成分淫羊藿苷、补骨脂素、齐墩果酸3种补肾中药有效成分能对抗自由基，抑制脂质过氧化物，有膜稳定及抗氧化保护作用，均对AD造成的神经元损伤具有保护作用，可下调SAMP8小鼠海马组织APP及PS1基因的表达，进而达到治疗老年性痴呆作用［10-11］。

氧化应激的发生与AD密切相关，AD的发生涉及到位于Aβ斑块附近的小胶质细胞激活，产生活性氧，通过模式识别受体与非模式识别受体介导的无菌炎症反应和促炎症因子的释放［12］。抗氧化干预已广泛应用于衰老及衰老相关疾病的防治，已取得了较大进展［13］。通过抗氧化干预，机体内不但炎性反应较低，且伴以有效的抗炎网络，从而可充分中和氧化应激损伤相关的分子模式介导的慢性炎症复合物［14］。老年大鼠由于维持稳态调节系统衰老，体内存在促炎细胞因子表达上调，导致促-抗炎细胞因子网络和促-抗炎性反应体系平衡失调，而采用中药淫羊藿总黄酮和淫羊藿苷可通过下调内源性促炎性细胞因子的表达和上调内源性抗炎性细胞因子的表达，重塑促-抗炎性细胞因子网络和促-抗炎性反应体系新的平衡，达到干预炎性衰老的目的［15］。而ICA改善SAMP8小鼠学习记忆的作用与其抗氧化活性有关［16］。

SAMP8小鼠的学习记忆障碍发病机制与其脑中异常的氧化应激有关。SAMP8小鼠在幼年时体内的代谢速度随之加快，处于较高的氧化-还原失衡的氧化应激状态。机体氧化应激导致细胞功能异常，是诱发多种疾病的重要原因之一。抗氧化剂通过抑制或减缓自由基的生成对修复机体的氧化损伤有重要的作用［17］。中药有效成分具有明确的抗氧化作用，可显著增强SAMP8小鼠大脑皮质和血清中氧化物质的活性以清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应，减轻或缓解氧化损害［18］。这与减少小胶质细胞活化和单核巨噬细胞在损伤部位积聚等有关［19］。本研究结果表明，模型组SOD、CAT和GSH-Px活性均低于对照组，说明模型组小鼠的SOD、CAT和GSH-Px协同清除能力的下降加剧了氧化应激损伤，与AD的发生具有密切关系。治疗组小鼠SOD、CAT和GSH-Px活性均高于模型组，表明淫羊藿苷、补骨脂素、齐墩果酸3种补肾中药对SAMP8小鼠的氧化应激损伤具有一定保护作用。中药有效成分对快速老化痴呆模型所致的SOD、GSH-Px和CAT水平低下具有保护作用，使SOD、GSH-Px和CAT水平升高，增强机体抗氧化能力，清除自由基而发挥其抗痴呆、延缓衰老的作用［20］。本研究还发现治疗组SOD、GSH-Px和CAT活性仍低于对照组，表明补肾中药有效成分并不能完全消除SAMP8小鼠的氧化应激损伤。因此，临床上治疗AD时，尚需结合其他药物或手段以及长期系统的进行治疗。

预防医学研究前沿“氧化应激窗口理论”指出，如果能在氧化应激窗口期进行预防医学干预及临床药物干预，就能避免氧化应激对机体造成疾病伤害。说明疾病预防的干预时期非常重要。错过了预防时机，将增加疾病风险，也给治疗带来困难。因此，针对氧化应激的预防、修复和防御等措施也在不断深入研究，应用抗氧化剂进行体内抗氧化是最有效的手段［21］，这和中医“治未病”的未病先防、已病防变、已变防渐等理论是相符的，这也表明了应用中医药抗氧化治疗AD的广阔前景。

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（本文编辑：高杉，于春泉）

Effect of effective com ponentsof Chinesem edicine for tonifying kidney on the levelsof oxidative stress in SAM P8m ice

WANGZhan-kui，ZHOU Zhen，ZHANGLin-lin，LIUShuang，SONGWan-shan，GUO Jia-kui，ZHANGYu-lian
（C enter of Acupuncture and Encephalopathy，The Second Affiliated Hospitalof Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300150，Chin a）

［Objective］To observe the effect of effective components in tonifying kidney herbs of psoralen，oleanolic acid，icariin on oxidative stress levelwithmice（SAMP8）.［Methods］Thisexperimentchose september-agedmale SMAP8mice，according to the random number tablemethod were random ly divided into psoralen group，oleanolic acid group，icariin group and model group.At the same time another age segment SAMR1mice were chosen as control group.The treatmentgroup were given psoralen（50mg/kg），oleanolic acid（50mg/kg），icariin（20mg/kg）by gavage，saline controlgroup andmodelgroup were given the same amountof gastric perfusion，0.3mL each time，1 timea day，continuous intragastric administration for4weeks，then the ratswere killed by decapitation and getting thebrain. Using enzyme-linked immunosorbentassay（ELISA）method for detecting the contentsofglutathion peroxidase（GSH-Px），catalase（CAT），superoxide dismutase（SOD）in cerebral cortex of SMAP8.［Results］SOD，CAT and GSH-Px activity in SAMR1micewere decreased compared with age-matched of SMAP8 in the cerebral cortex；cerebral cortex SOD，CAT and GSH-Px activity in themodel group were lower than the controlgroup，after 4 weeksof treatment，SOD，CATand GSH-Px activity in the cerebral cortex of the treatmentgroup were higher than those in themodelgroup，and therewasno significantdifferencebetween psoralen，oleanolic acid，icariin threegroups of the above indicators（P＞0.05）.［Conclusion］The kidney tonifying herbshas certain protective effect on oxidative stress injury in SAMP8，so as toachieve theeffectofprevention and treatmentofsenile dementia.

kidney tonifying herb；senile dementia；psoralen；oleanolic acid；icariin；oxidative stress；SAMP8mice

R285.5

A

1672-1519（2015）02-0102-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.02.10

国家重点基础研究发展计划（973）计划项目（2010CB530405）；国家自然科学基金资助项目（81102577）。

王占奎（1977-），男，博士，主治医师，主要研究方向为中西医结合治疗脑病的临床与基础研究。

张玉莲，E-mail：zhyl220@126.com。

（2014-10-12）