正交实验优化独活总香豆素的渗漉提取工艺*

王春鹏，罗　倩，李　晋，何　俊，马文芳，刘二伟，常艳旭

正交实验优化独活总香豆素的渗漉提取工艺*

王春鹏，罗倩，李晋，何俊，马文芳，刘二伟，常艳旭

（天津市现代中药重点实验室，天津中医药大学，天津300193）

［目的］研究独活总香豆素的最佳渗漉提取工艺。［方法］采用L9（34）正交实验法，考察乙醇浓度、料液比、浸泡时间对独活提取物中蛇床子素、二氢山芹醇乙酸酯、二氢山芹醇、二氢山芹醇当归酸酯含量的影响。［结果］乙醇浓度为影响独活总香豆素渗漉提取效果的主要因素，最佳提取工艺为75%乙醇，料液比为1∶8，浸泡8 h。［结论］此方法可作为独活总香豆素的最佳渗漉提取工艺。

独活；渗漉提取；正交实验；HPLC

独活（Radix Angelicae Pubescentis）始载于《神农本草经》，具有祛风除湿、通痹止痛、宣通百脉等功效。独活是伞形科植物重齿毛当归（Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan）的干燥根及根茎，现代临床常用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、中风偏瘫、头痛、慢性气管炎等病症［1］。近年来，随着相关研究的不断深入，在独活药理作用［2］和主要成分含量测定方面［3-5］的研究取得进一步发展。独活主要化学成分为香豆素和挥发油类，还含有多糖、有机酸和甾醇等成分［6］。研究证明，独活中香豆素为其主要的药理活性成分［7］。为进一步促进独活香豆素的开发利用，对其提取方法的研究是十分必要的。目前常用独活香豆素的提取方法以热回流法［8］和超声提取［9］报道最多。热回流法不仅耗时过长，而且有机溶剂用量多，超声提取虽然省时、提取效率高但是其价格昂贵且不适用于大规模的生产，而本实验中渗漉提取法具有操作简便、提取率高的优点，并且可以避免因加热和超声时间过长引起的化合物受热损失。本研究以独活香豆素中蛇床子素、二氢山芹醇乙酸酯、二氢山芹醇、二氢山芹醇当归酸酯为评价指标，通过正交实验设计［10-13］，考察乙醇浓度、料液比、浸泡时间3个因素对提取效果的影响，确定渗漉提取独活总香豆素的最佳工艺条件。

1　仪器、试剂与样品

Waters 2695高效液相色谱仪，包括二元梯度泵，自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器（DAD），Empower色谱工作站。

蛇床子素、二氢山芹醇乙酸酯、二氢山芹醇当归酸酯对照品均购于成都曼斯特生物科技有限公司，对照品二氢山芹醇为本课题组从独活中分离鉴定，经高效液相色谱（HPLC）分析，其含量达98%以上，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

独活药材为作者购自河北安国，经天津中医药大学常艳旭副研究员鉴定为独活（Radix Angelicae Pubescentis）。粉碎后过4号筛，备用。

2　方法与结果

2.1独活总香豆素的HPLC测定

2.1.1色谱分离条件色谱条件参考文献［5］，色谱柱为Phenomenex Luna C18（4.6mm×250mm，5μm），流动相：乙腈（A）-水（B），二元梯度洗脱：0～5min，20%～25%A；5～10 min，25%～30%A；10～15 min，30%～38%A；15～35 min，38%～60%A；35～40 min，60%～80%A；40～50 min，80%A；50～55 min，80%～20%A；55～60min，20%A。检测波长为325nm，进样量为10μL，流速1mL/min，柱温25℃。

2.1.2标准曲线制备精密称取蛇床子素、二氢山芹醇乙酸酯、二氢山芹醇、二氢山芹醇当归酸酯对照品适量，加甲醇溶解，配制成蛇床子素、二氢山芹醇乙酸酯、二氢山芹醇、二氢山芹醇当归酸酯浓度均为2 g/L的标准溶液。分别移取各标准品溶液适量，加入甲醇稀释得到浓度各为0.08，0.16，0.24，0.32，0.40，0.80 g/L的混合标准溶液，备用。

2.1.3测定精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2正交实验设计本次研究主要考察了使用不同乙醇浓度、不同料液比、不同浸泡时间对于独活总香豆素的影响，各选取3个水平，以L9（34）正交表安排实验，实验设计因素水平见表1。

表1　正交实验因素水平表Tab.1　Factor and level in theorthogonaldesign

3　实验结果

3.1方法学考察

3.1.1线性关系考察按照2.1.1色谱条件分别测定各混合标样，以对照品进样浓度（X），各单体香豆素峰面积（），进行线性回归，得线性方程：蛇床子素=57 373X-105，r2=0.999 3；二氢山芹醇乙酸酯= 45 990X+22 958，r2=0.999 4；二氢山芹醇=41 000X+ 16 057，r2=1.000；二氢山芹醇当归酸酯=35 363X+ 17 226，r2=9 995。

3.1.2精密度实验取同一样品溶液连续进样5次，测定峰面积后计算RSD分别为蛇床子素2.04%，二氢山芹醇乙酸酯0.67%，二氢山芹醇1.87%，二氢山芹醇当归酸酯2.54%，表明仪器精密度良好。

3.1.3重现性实验取同一样品溶液5份平行操作，测定峰面积后计算RSD分别为蛇床子素0.56%，二氢山芹醇乙酸酯1.22%，二氢山芹醇1.09%，二氢山芹醇当归酸酯1.94%。说明实验方法重现性较好。

3.1.4稳定性实验取同一样品分别于0、2、4、6、8和24h进样，峰面积RSD分别为蛇床子素1.82%，二氢山芹醇乙酸酯1.88%，二氢山芹醇1.53%，二氢山芹醇当归酸酯0.94%。说明样品在24 h内稳定。

3.2渗漉提取方法和供试品溶液处理取独活药材粉末10.0 g，精密称定，乙醇润湿2 h后装柱，用以上各条件进行实验，渗滤速度为0.5mL/min，收集渗漉液，浓缩干燥，加入40mL甲醇溶解，摇匀，取1mL溶液过0.45μm有机滤膜，测定含量。结果见表2。

4　讨论

本研究对正交实验中不同排列组合条件进行了综合比较，结果显示A2B3C1的得率最高为4.44%。方差分析表明，影响渗漉提取液中蛇床子素、二氢山芹醇乙酸酯、二氢山芹醇、二氢山芹醇当归酸酯和总香豆素含量因素的大小分别为乙醇浓度＞料液比＞浸泡时间，其中乙醇浓度（A）为影响蛇床子素、二氢山芹醇、二氢山芹醇当归酸酯和总香豆素含量的主要因素，各水平之间差异有统计学意义（P＜0.05），而料液比（B）和浸泡时间（C）均为次要因素，各水平之间差异无统计学意义。直观分析表明，料液比在B2水平下，蛇床子素、二氢山芹醇乙酸酯、二氢山芹醇当归酸酯和总香豆素的含量均最高。在B3水平下，二氢山芹醇含量最高，但B2和B3差异未达到显著水平，根据极差值及节约溶剂、降低成本的生产实际，综合蛇床子素、二氢山芹醇乙酸酯、二氢山芹醇、二氢山芹醇当归酸酯和总香豆素的正交实验结果，确定最佳渗漉工艺为A2B2C1，即75%乙醇，料液比1∶8，浸泡时间8 h。

香豆素类能溶于水、甲醇、乙醇，而难溶于乙醚、苯等极性小的溶剂［14］。考虑对总香豆素的溶解与安全等因素，本实验选择乙醇作为提取独活总香豆素的溶剂。正交实验表明，75%乙醇渗漉提取的总香豆素含量高于60%乙醇及95%乙醇的提取效果，原因可能是75%乙醇对总香豆素不仅有较好的溶解性，同时对药材细胞还有较强的穿透能力。

独活总香豆素中含有挥发性成分，且欧前胡素容易受热产生成分变化［15］，不宜加热提取，有关其他成分稳定性的报道也较少［16］，因此，渗漉法对于独活总香豆素的提取是可取的。该提取方法工艺简单，节约能耗，对研究香豆素类成分的提取分离具有一定的参考价值。

表2　正交实验结果及数据分析Tab.2　The resu ltsand data analysisof orthogonaldesign

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（本文编辑：高杉，于春泉）

Optim ization orthogonalofpercolation extraction processof Radix Angelicae Pubescentiscoumarin

WANGChun-peng，LUOQian，LIJin，HE Jun，MAWen-fang，LIUEr-wei，CHANGYan-xu
（Tianjin State Key Laboratory ofModern ChineseMedicine，Tianjin University of TraditionalChineseMedicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To investigate the bestpercolation extraction condition of Radix Angelicae Pubescent coumarin.［M ethods］L9（34）orthogonalexperimentalmethod wasused to study the effectsofethanol concentration，solid-liquid ratio，soaking time on the contents of osthole，columbianetin acetate，columbianetin and columbianadin in Radix Angelicae Pubescentextract.［Results］Ethanol concentration was themain factor of affecting percolation，and the optimum extraction was 75%ethanol，solid-liquid ratio of 1∶8，soak 8 hours.［Conclusion］Thismethod could beused as the bestpercolation extraction processof Radix Angelicae Pubescentis coumarin.

Radix Angelicae Pubescentis；percolation；orthogonal test；HPLC

R282.4

A

1672-1519（2015）02-0113-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.02.13

高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（201012101 20007）。

王春鹏（1987-）男，硕士研究生，从事中药药效物质基础研究。

常艳旭，E-mail:tcmcyx@126.com。

（2014-09-23）