钴铬合金与钛合金修复材料的细胞相容性研究

严涛

钴铬合金与钛合金修复材料的细胞相容性研究

严涛

目的 研究2种牙科金属材料钴铬合金、钛合金浸提液对人牙龈成纤维（HGF）细胞的细胞相容性。方法 以钴铬合金、钛合金的浸提液培养HGF细胞，以含10%胎牛血清的DMEM培养基作为空白对照。采用MTT法在细胞水平评价2种牙科金属材料的细胞毒性，使用试剂盒检测细胞中还原型谷胱甘肽（rGSH）的含量，采用ELISA法检测2种牙科金属材料浸提液对HGF细胞肿瘤坏死因子（TNF）-α分泌的影响，采用实时PCR（real-time PCR）在基因水平检测2种牙科金属材料浸提液对HGF细胞凋亡相关基因caspase-3 mRNA表达的影响。结果 钴铬合金组抑制了HGF细胞增殖，与空白对照组差异有统计学意义，钛合金组促进了HGF细胞增殖。与空白对照相比，钴铬合金组抑制了HGF细胞rGSH的产生（P＜0.05），促进了HGF细胞TNF-α的分泌（P＜0.05），而钛合金对HGF细胞rGSH产生、TNF-α分泌没有明显影响；钴铬合金组caspase-3的基因表达高于空白对照组（P＜0.05），而钛合金对caspase-3基因表达无明显影响。结论 钴铬合金对HGF细胞具有一定的细胞毒性，而钛合金细胞相容性良好。

铬合金；钛；谷胱甘肽；肿瘤坏死因子α；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；钴铬合金；钛合金；人牙龈成纤维细胞；细胞相容性

过去几十年间，随着对金、钯等贵金属合金价格管制的放宽，人们开始寻求新的非贵金属合金［1］。在选择合金的过程中需要考虑的一个重要因素就是它的生物学性质。近年来，钴铬合金［2］及钛合金因其良好的机械性能在口腔修复领域得到了大量应用。由于口腔内唾液的溶解、细菌活性及温度等综合因素的影响，金属材料处于一个易于生物降解的环境中［3］。金属离子释放到口腔后，会接触毗邻的细胞及组织，并通过血液流动而分布到全身各处，可能导致细胞毒性、过敏等不良反应。因此对于口腔内金属材料的生物安全性评价尤为重要。本研究选取人牙龈成纤维（HGF）细胞，观察2种金属浸提液的细胞毒性，及对细胞内还原型谷胱甘肽（rGSH）含量及肿瘤坏死因子（TNF）-α分泌的影响，并进一步利用实时PCR（real-time PCR）技术检测caspase-3基因表达的变化，旨在评价2种口腔修复科常用金属材料的细胞相容性，为其临床应用提供指导。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 钴铬合金、钛合金购自Bego公司。钴铬合金成分：钴（Co）61%、铬（Cr）24%、钼（Mo）7%、钨（W）4.5%，Si、Fe、Ce各小于2%。钛合金成分：钛（Ti）4%，镍（Ni）62%，Cr 17%。DMEM培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；Ⅰ型胶原酶、MTT购自美国Sigma公司；DMSO购自美国Amerisco公司；逆转录试剂盒、SYBRGreen购自TaKaRa公司；rGSH测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子（TNF）-α ELISA试剂盒购自吉泰远成生物科技有限公司；real-time PCR仪（Bio-Rad公司，美国）。

1.2 浸提液制备 将钴铬合金、钛合金分别铸造成直径6 mm，高3 mm的圆柱体，打磨、抛光后，超声清洗15 min。用去离子水冲洗数遍后，置于玻璃小瓶中，将不同合金的金属片于121℃高压灭菌后，置于24孔板中。每孔加2 mL含10%胎牛血清的DMEM培养液。在37℃、5%CO2条件下连续浸提7 d，将浸提液用0.2 μm过滤器过滤，4℃冰箱保存，备用。

1.3 HGF细胞的原代培养 选取20～24岁青少年因正畸拔除的前磨牙，用PBS（含双抗）反复冲洗，无菌条件下刮取牙颈部的牙龈组织，剪碎后用2.0×105U/LⅠ型胶原酶37℃消化1 h，800 r/min离心5 min，弃上清，用无血清DMEM培养液悬浮组织，800 r/min离心5 min，弃上清，加适量含10% FBS的DMEM培养液，连同组织块转至6孔板，37℃、5% CO2条件下培养。每2～3 d换液1次，取第3～5代细胞用于实验。

1.4 MTT实验 将HGF细胞按照1×104/孔的浓度接种于96孔板，每组设6个复孔。待细胞贴壁后，弃去原液，加入2种金属浸提液，培养24 h后，加入20 μL MTT（5 g/L）作用4 h，然后加入150 μL DMSO溶解结晶，用分光光度仪（Labsystems Dragon Wellscan MK3，Finland）在570 nm和630 nm处测量光密度（OD）值。按OD值计算细胞活力。计算细胞相对增殖R，R=（实验组OD值/对照组OD值）×100%，正常培养液组为空白对照组。

1.5 细胞内rGSH含量的测定 HGF细胞经胰酶消化后，调整细胞密度为1×105/孔接种于6孔板中，每孔2 mL，待细胞进入对数生长期时，加入2 mL金属浸提液，同时设置空白对照组（正常DMEM培养液）。置于5%CO2、37℃培养箱中孵育24 h，PBS洗涤细胞1次，离心收集细胞，吸尽上清，加入细胞沉淀体积3倍量的偏磷酸缓冲液充分混悬，利用液氮和37℃水浴对样品进行3次快速的冻融，4℃、3 500 r/min离心10 min，吸取上清液，按照试剂盒说明书测定rGSH含量。用Bradford法测定细胞蛋白水平校正细胞内rGSH含量。

1.6 ELISA实验 将成纤维细胞以1×106/孔接种于6孔板中。24 h后每孔加入2 mL上述金属浸提液，作用24 h后，收集上清，严格按照试剂盒说明书操作测定TNF-α含量，正常培养液组为空白对照组。

1.7 real-time PCR实验 用real-time PCR方法研究金属浸提液对HGF细胞caspase-3基因表达的影响。使用2种牙科金属材料浸提液处理HGF细胞24 h后，使用TRIZOL试剂（Invitrogen，USA）提取总RNA。使用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis kit（TaKaRa，Japan）将1.0 μg RNA逆转录为cDNA，采用real-time PCR试剂（SYBR Premix EX Taq，TaKa-Ra），在Bio-Rad系统（MyiQ2，USA）上进行real-time PCR检测。以GAPDH为内参照，数据用ΔΔCt方法进行分析，用GAPDH进行标化。正常培养液组为空白对照组。引物序列见表1。

Tab.1 Primers used for real time RT-PCR表1 Real-time PCR实验中所用的引物

1.8 统计学方法 使用SPSS 11.0软件进行数据统计分析。3次独立实验取得的数据以均数±标准差表示，组间比较使用单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HGF细胞形态观察 HGF细胞贴壁生长，呈梭形，伸展良好，见图1。

Fig.1 Microscopic image of human gingival fibroblasts（×10）图1 人牙龈成纤维细胞镜下观察（×10）

2.2 2种合金对HGF细胞增殖率的影响 与空白对照组相比，钴铬合金组抑制了HGF细胞的增殖，而钛合金促进了HGF细胞的增殖，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

Tab.2 Effects of leaching solution of Co-Cr and Ti alloy on proliferation of human gingival fibroblasts表2 钴铬合金与钛合金对HGF细胞增殖率的影响

2.3 2种合金对HGF细胞内rGSH产生、TNF-α分泌及caspase-3基因表达的影响 与空白对照相比，钴铬合金组抑制了HGF细胞rGSH的产生（P＜0.05），促进了HGF细胞TNF-α的分泌（P＜0.05），而钛合金对HGF细胞rGSH产生、TNF-α分泌没有明显影响；钴铬合金组caspase-3的基因表达高于空白对照组（P＜0.05），而钛合金对caspase-3基因表达无明显影响，见表3。

Tab.3 Effects of leaching solution of Co-Cr and Ti alloy on rGSH，TNF-α production and caspase-3 mRNA expression of human gingival fibroblasts表32 种合金对HGF细胞rGSH产生、TNF-α分泌及caspase-3基因表达的影响（n=3，±s）

Tab.3 Effects of leaching solution of Co-Cr and Ti alloy on rGSH，TNF-α production and caspase-3 mRNA expression of human gingival fibroblasts表32 种合金对HGF细胞rGSH产生、TNF-α分泌及caspase-3基因表达的影响（n=3，±s）

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3 讨论

钴铬合金具备贵金属合金与非贵金属合金的优点，其可用于固定义齿修复，尤其是可摘局部义齿的支架，但钴铬合金的生物相容性有待观察［4］。钛合金的大量应用是因为其耐腐蚀和良好的物理性能［5］。尽管牙科合金释放的金属离子不会造成全身系统性毒性，但合金与组织的紧密接触会创造一个微环境，例如龈沟和支架区有较高的金属离子浓度，因此，对于钴铬合金与钛合金的细胞相容性评价是十分必要的。

HGF细胞是人牙龈结缔组织和牙周膜中的主要细胞类型，在牙齿的发育、牙周组织的生理病理改变及牙周组织再生等方面具有重要作用［6］。MTT结果显示，钴铬合金浸提液抑制了HGF细胞的增殖，而钛合金浸提液促进了细胞增殖，这一结果与al-Hiyasat等［7］的研究结果相似，他们发现钴铬合金浸提液具有一定的细胞毒性。活性氧（ROS）主要包括羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢，过多的ROS所引起的氧化应激，会导致细胞DNA损伤，正常生理活动下ROS产生量很少，且可以被rGSH清除，rGSH是一种低分子清除剂，可以清除活性中间体或直接淬灭自由基等［8］。rGSH的产生量可以间接衡量ROS的产生量。本研究发现，与空白对照组相比，钴铬合金组的rGSH量有所降低，表明钴铬合金诱导HSF细胞产生了较为显著的ROS，引起了氧化应激，而钛合金组却没有导致rGSH的变化，表明其没有引起细胞ROS的变化，细胞保持了正常的功能状态。TNF-α是重要的细胞因子，在炎症反应和细胞免疫应答中发挥着重要的作用，同时，其还可介导细胞的凋亡［9］。与空白对照组相比，钴铬合金引起了TNF-α的显著分泌，表明钴铬合金引起了较为显著的免疫反应，而钛合金却没有引起TNF-α的增加。上述结果表明，钴铬合金具有一定的细胞毒性，进一步在基因水平研究发现钴铬合金促进了caspase-3的基因表达，而钛合金对其表达没有明显影响。Caspase-3是caspases级联反应中的关键效应分子，caspase-3被激活后依次裂解细胞内其他蛋白底物，最终会触发细胞凋亡［10］。上述结果显示，钴铬合金的细胞毒性可能是由于其激活了caspase-3基因的表达进而诱导了细胞凋亡所引起。钴铬合金具有一定的细胞毒性，而钛合金细胞相容性较好。

［1］Atluri KR，Vallabhaneni TT，Tadi DP，et al.Comparative evaluation of metal-ceramic bond strengths of nickel chromium and cobalt chromium alloys on repeated castings:an in vitro study［J］.J Int Oral Health，2014，6（5）:99-103.

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（2014-07-23收稿 2015-01-09修回）

（本文编辑 李国琪）

The study of cytocompatibility of Co-Cr alloy and Ti alloy

YAN Tao
Department of Stomatology，Weifang People's Hospital，Shandong 261041，China

Objective To investigate the cytocompatibility of the liching liquids of Co-Cr alloy and Ti alloy on human gingival fibroblasts（HGF）.Methods The HGF were treated in vitro with leaching liquids of Co-Cr alloy and Ti alloy，respectively.The DMEM cell medium containing 10%fetal bovine serum was served as a negative control.The viability of HGF treated by two dental alloys were evaluated by means of MTT，and the contents of intracellular reduced glutathione （rGSH）were assayed by kits.The tumor necrosis factor-α（TNF-α）contents were determined in the culture supernatant by ELISA in two groups.The effects of these alloys on the expression of caspase-3 were examined by real time-PCR method.Results Compared with the control group，HGF treated with Co-Cr alloy leaching liquids showed a lower viability（P＜0.05），while Ti alloy leaching liquid promoted the proliferation of HGF.In Co-Cr alloy group，the rGSH content was significantly decreased（P＜0.05），while TNF-α content was significantly increased（P＜0.05）compared with control group.There were no significant differences in rGSH and TNF-α contents between the Ti alloy group and control group（P＞0.05）.The expression of caspase-3 was significantly higher in Co-Cr alloy group than that of control group（P＜0.05），while there was no significant difference in the expression of caspase-3 between Ti alloy group and control group.Conclusion Results suggest that Co-Cr alloy possesses cytotoxicity，while there is better cell compatibility for Ti alloy.

Chromium alloys；Titanium；glutathione；tumor necrosis factor-alpha；caspase 3；Co-Cr alloy；Ti alloy；human gingival fibroblast；cytocompatibility

R783.1

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.021

山东省潍坊市人民医院牙科（邮编261041）

严涛（1971），男，主管技师，学士学位，主要从事口腔修复研究