弥漫型肝细胞癌的克隆起源研究

张鲁洲，王政禄，王玉亮，郑虹∆

临床研究

弥漫型肝细胞癌的克隆起源研究

张鲁洲1，王政禄2，3，王玉亮2，4，郑虹2，3∆

目的 探究弥漫型肝细胞癌（D-HCC）的肿瘤克隆起源方式及其行肝移植治疗的预后。方法 选取2004 年8月—2012年11月天津市第一中心医院肝移植治疗的14例D-HCC患者，收集患者一般资料及术后无瘤生存资料。选取12个高频肝癌微卫星杂合性缺失（LOH）位点，通过聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）评估D-HCC的肿瘤克隆起源方式。结果 14例D-HCC患者中，有11例单中心克隆起源（IM），3例单中心伴多中心克隆起源（IM+MO）。术后无瘤生存时间为4.5～37.4个月，无瘤生存中位时间为8.7个月。结论 D-HCC的肿瘤克隆起源方式以IM为主，肝移植可能是较为有效的治疗手段。

癌，肝细胞；杂合子丢失；肝移植；弥漫型肝细胞癌；克隆起源

弥漫型肝细胞癌（diffuse hepatocellular carcinoma，D-HCC）是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中最罕见的类型之一［1］。其发病常基于中重度肝硬化，临床上通过影像学表现很难与肝硬化区分。由于D-HCC发病率较低、缺乏相对有效的治疗手段，且其癌灶弥漫于全肝，故无法进行手术切除，而单纯的放化疗效果并不理想，预后很差。一直以来对D-HCC的研究较多结节肝细胞癌少。目前，国内外针对D-HCC的研究多倾向于对该病的诊断［2-4］，而对该病中癌灶的生物学特性方面的研究罕有涉及。笔者对病肝通过肝癌微卫星杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）探讨癌组织克隆起源及D-HCC的生物学特性，为移植治疗D-HCC的可行性提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2004年8月—2012年11月天津市第一中心医院收治的原位肝移植治疗的14例D-HCC患者资料。根据WHO对D-HCC的定义，选取了术后经病理证实肿瘤结节直径0.1～1.5 cm，且均匀分布于全肝的病例。本研究通过了医院伦理委员会审批。患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 临床数据收集 （1）记录性别、年龄、肝病背景及术前血清甲胎蛋白（AFP）水平。（2）从每个切除肝脏的4个不同位置分别获得肿瘤组织，且每一部位相距＞5 cm。所有标本常规方法进行福尔马林固定和石蜡包埋，4 μm石蜡切片，常规HE染色。由2位病理学专业医生共同诊断作为最后诊断结果。

1.2.2 DNA提取和PCR 对石蜡包埋标本进行10 μm厚度、5～10张数量的切片，常规二甲苯-梯度乙醇方法脱蜡。在显微切割显微镜下通过显微切割获得癌组织和非癌组织。提取癌及非癌组织的DNA，提取方法依照试剂盒提供的流程进行，试剂盒购自成都福际生物技术有限公司。参考文献［5-8］，选取12个微卫星高频LOH位点。根据位点信息由宝生物（大连）公司合成相关引物。本研究中使用12个微卫星引物，见表1。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR产物10 μL加入2 μL上样缓冲液［6×DNA-Loading Buffer，由宝生物（大连）公司生产］，放入95℃恒温水浴锅10 min变性，然后迅速放置在冰上10～15 min，将处理好的样品加入到已经制备好的8%变性聚丙烯酰胺凝胶上，在100 V下电泳2 h，对凝胶进行银染［7］显色后，判定LOH。PCR反应与变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行至少2次，以确认LOH判定的准确性。

Tab.1 Characters of 12 microsatellite markers表1 微卫星引物详情

1.2.4 LOH分析 在信息性病例中（根据2个等位基因的4条单链在变性聚丙烯酰胺不同的构象，通过电泳进行分离，如果条带≥3为杂合子），与正常组织相比，肿瘤的DNA扩增产物条带消失或密度减少50%及以上的判定为LOH。相反，如肿瘤的DNA扩增产物条带密度无减少或减少＜50%以上，则为杂合性保留。参考以往对LOH用于肝癌克隆起源的研究，其判断标准［9］：如2个肿瘤之间不同位点的LOH结果≥30%不同，则认为其多克隆起源，即多中心发生（multicentric occurrence，MO）；如2个肿瘤之间LOH结果相同或均为杂合性保留，则认为是单克隆起源，即单中心发生（introhepatic metastasis，IM）；而＜30%不同被认为是无法判断克隆起源。比较每例D-HCC患者的不同部位癌组织在不同的微卫星位点LOH的差异，作为判断肝细胞癌不同克隆起源的分子生物学依据。

1.2.5 随访 以术后3年内D-HCC患者肿瘤有无复发为随访终点，收集14例患者的术后无瘤生存时间资料，绘制患者Kaplan-Meier生存曲线。

1.3 统计学方法 采用SPSS 15.0统计学软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。

2 结果

2.1 患者一般特征 14例患者中男13例，女1例，年龄47～67岁，平均（54±6）岁。伴有乙肝肝硬化9例，丙肝肝硬化3例，乙、丙肝肝硬化2例。9例术前AFP水平＞20 μg/L，其中6例＞500 μg/L。

2.2 LOH的发生频率及克隆起源类型判定 所有D-HCC在1个或几个位点均发生了LOH。统计位于 1p36.3、1p36.1、4q26、8p23、13q14.3、16q12.1、16q24.1、16q21、17p13.3、17p13.1的肝癌LOH的高频位点D1S243、D1S507、D4S402、D4S406、D8S277、D8S520、D13S268、D16S419、D16S505、D16S514、D17S831、D17S938发生LOH的频率分别为21.4% （3/14）、35.7%（5/14）、28.6%（4/14）、21.4%（3/14）、28.6%（4/14）、28.6%（4/14）、21.4%（3/14）、28.6% （4/14）、14.3%（2/14）、35.7%（5/14）、35.7%（5/14）和21.4%（3/14），有代表性的结果见图1。LOH在12个位点的发生频率见表2。本研究中，11例癌灶克隆起源为IM，3例为IM和MO同时存在，结果显示尽管有3例患者的癌灶克隆起源为2种，但这并不影响笔者得出D-HCC中存在广泛转移这一结论。

Fig.1 Decision of LOH in D-HCC图1 D-HCC杂合性缺失的判定

Tab.2 Frequency of LOH at 12 microsatellite loci in D-HCC表2 12个肝癌微卫星位点发生杂合性缺失的统计

2.3 治疗及随访情况 14例患者手术方式均为原位肝移植术，且术后均采用“他克莫司+塞尼哌+霉酚酸酯+甲基强的松龙”的免疫抑制方案。14例无瘤生存时间为4.5～37.4个月，中位时间为8.7个月，其中3例无瘤生存时间超过24个月。患者的Kaplan-Meier生存曲线，见图2。

Fig.2 Kaplan-Meier survival curves of D-HCC patients图2 D-HCC患者的生存曲线

3 讨论

3.1 D-HCC的特点 D-HCC常伴有显著的肝硬化，因其肿瘤大小与质地较普通的肝硬化结节较难区分，临床上，如影像学医师的经验不够丰富，有时会将其漏诊而单纯诊断为肝硬化。有研究总结D-HCC的特点，主要为全肝弥漫结节，是D-HCC的特征性表现，主要特点为：肿瘤呈广泛性粟粒状、结节状分布，早期肿瘤病灶较小，晚期多呈结节状；结节可大小不等，但大多局限于0.1～2.0 cm，布满整个肝脏；其次表现为肝肿大，为D-HCC的较特征性表现，由于此型肝癌多伴有肝硬化，因此肝脏在早期常常表现为轮廓饱满，呈整体普遍性增大［2，10］。本组14例患者中，经术后病理证实肿瘤结节直径0.1～1.5 cm；11例患者的病肝较正常肝脏体积增大，有3例显示肝脏体积缩小，这3例同时发现其肝硬化程度为重度，此时肝脏体积缩小可能与肝硬化的严重程度有关。

3.2 D-HCC的克隆起源 本组所有患者瘤灶均发现了IM，其中3例伴有MO，证实了D-HCC存在广泛的肝内肿瘤转移，这可能与D-HCC的发生机制有关，也有可能与D-HCC的疾病进展有关。本研究显示广泛的肝内转移是D-HCC的最大特征，提示D-HCC的预后很差。此外，笔者发现部分患者的术前AFP水平较高，这一现象提示临床医师应注意肝硬化伴血清AFP高值的患者，在影像学未发现明显肿瘤时，需要重点与D-HCC相鉴别。

3.3 D-HCC的治疗 D-HCC虽较少见，但其预后极差，目前的治疗手段主要有放、化疗及支持治疗。因肿瘤弥漫于整个肝脏，故无法行切除术，只能进行姑息性治疗。有研究通过手术或介入的方法治疗D-HCC，但几乎没有令人满意的效果［2，10-11］。本组患者移植术后随访发现，有3例患者的预后较好。鉴于此，笔者认为肝移植手术可能是有效的治疗手段，但由于病例相对较少，因此需要在今后的研究中进一步论证。D-HCC目前尚无统一的治疗手段且预后较差，因此寻求有效的治疗手段对于D-HCC患者有重大意义，而探索D-HCC发生的机制，则有助于为临床治疗提供一定的理论参考依据。

目前，对于D-HCC的诊断，涉及到具体肿瘤的大小及个数的标准尚未明确，而在原发性肝细胞癌中，常见的多结节肝细胞癌的诊断也没有对肿瘤的个数在上限上做出明确标准。笔者认为，多结节肝细胞癌和D-HCC的诊断在肿瘤数目上应该有一个明确的分界，确定这个分界或许可以对D-HCC有更加深刻的认识。总之，D-HCC由于其发病率较低，因此诊断相对困难，且缺乏有效统一的治疗手段，预后较差，在今后的研究中需要对其发病机制、诊断与治疗作更加深入的探讨。

［1］Zhang MR，Wang HL.Value of ultrasound in the diagnosis of diffuse hepatocellular carcinoma［J］.Journal of Practical Medical Techniques，2014，21（6）：617-618.［张美荣，王宏亮.超声对弥漫型肝癌的诊断价值［J］.实用医技杂志，2014，21（6）：617-618］.doi: 10.3969/j.issn.1008-6978.2007.02.020.

［2］Makino H，Kametaka H，Seike K，et al.A case of diffuse hepatocellular carcinoma（Vp4）treated by right hepatic trisegmentectomyandmultidisciplinary therapy regimens［J］.GanToKagaku Ryoho，2012，39 （12）:1997-1999.

［3］Kim YK，Han YM，Kim CS.Comparison of diffuse hepatocellular carcinoma andintrahepatic cholangiocarcinoma using sequentially acquiredgadolinium-enhanced and Resovist-enhanced MRI［J］.Eur J Radiol，2009，70（1）:94-100.doi:10.1016/j.ejrad.2008.01.015.

［4］Halýloðlu N，Özkavukcu E，Erden A，et al.MR imaging in diffusetype hepatocellular carcinoma with synchronous portal vein thrombi ［J］.Turk J Gastroenterol，2011，22（2）:158-164.

［5］Wang B.Clonal origins of multiple and recurrent hepatocellular carcinoma by detection of micrusatellite loss of heterozygosity:Diagnosis and clinical significance［D］.ShangHai:Second Military Medical University，2009.［王斌.微卫星杂合性缺失检测多结节性和复发性肝细胞癌克隆起源及其临床意义［D］.上海:第二军医大学，2009］.doi：10.7666/d.y1504478.

［6］Dong H，Cong WM，Xian ZH，et al.Using loss of heterozygosity of microsatellitesto distinguish high-grade dysplastic nodule from early minute hepatocellular carcinoma［J］.Exp Mol Pathol，2011，91（2）: 578-583.doi:10.1016/j.yexmp.2011.06.003.

［7］Zhu Z，Zhu HF，Gu YJ，et al.Two closely neighboring hepatocellular carcinomas mimicking intrahepatic metastasis are confirmed as double primary tumors by the loss of heterozygosity analysis of microsatellites［J］.Chinese Medical Journal，2013，126（16）:3187-3189.doi:10.3760/cma.j.issn.0366-6999.20130656.

［8］Lu T，Hano H，Meng C，et al.Frequent loss of heterozygosity in two distinct regions，8p23.1 and 8p22，in hepatocellular carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2007，13（7）:1090-1097.doi:10.3748/wjg.v13.i7.1090.

［9］Morimoto O，Nagano H，Sakon M，et al.Diagnosis of intrahepatic metastasis and multicentric carcinogenesis by microsatellite loss of heterozygosity in patients with multiple and recurrent hepatocellularcarcinomas［J］.J Hepatol，2003，39（2）:215-221.doi:10.1016/S0168-8278（03）00233-2.

［10］Liu JF，Long QY，Hu JX，et al.Imaging diagnosis and interventional therapy of diffuse type hepatic cellular carcinoma（A Report of 14 Cases）［J］.J Pract Radiol，2005，21（1）:68-71.［刘骏方，龙清云，胡金香，等.弥漫型肝癌的CT、DSA诊断及介入性治疗（附14例报告）［J］.实用放射学杂志，2005，21（1）:68-71］.doi：10.3969/j.issn.1002-1671.2005.01.020.

［11］Cannon RM，Urbano J，Kralj I，et al.Management of diffuse hepatocellular carcinoma（≥10 Lesions）with doxorubicin-loaded DC beads is a safe and effective treatment option［J］.Onkologie，2012，35 （4）:184-188.doi:10.1159/000337402.

（2014-10-20收稿 2014-12-29修回）

（本文编辑 李鹏）

The clonal origin of diffuse hepatocellular carcinoma

ZHANG Luzhou1，WANG Zhenglu2，3，WANG Yuliang2，4，ZHENG Hong2，3∆
1 First Central Clinical Institute of Tianjin Medical University，Tianjin 300192，China；2 Organ Transplant Center，Tianjin First Central Hospital；3 Key Laboratory of Organ Transplantation of Tianjin；4 Key Lab for Critical Care Medicine of the Ministry of Health
△Corresponding Author E-mail:zhenghongxy@163.com

Objective To determine the tumor clonal origin of diffuse hepatocellular carcinoma（D-HCC）and clinical outcome after liver transplantation.Methods Fourteen D-HCC patients who underwent liver transplantation in the Tianjin First Central Hospital between August 2004 to November 2012 were evaluated retrospectively.Their clinical characteristics and data of disease-free survival postoperatively were gathered.Twelve loss of heterozygosity sites（LOH）on high frequency microsatellite were selected.The tumor clonal origin of D-HCC was assessed by the means of PCR-SSCP.Results Of 14 D-HCC patients，intrahepatic metastasis（IM）occurred in 11 cases（11/14），and IM with multicentric occurrence（MO）occurred in 3 cases（3/14）.The disease-free survival time was 4.5 to 37.4 months，and the median time was 8.7 months.Conclusion The most frequent tumor clonal origin of D-HCC was IM.Liver transplantation may be the effective treatment for D-HCC.

carcinoma，hepatocellular；loss of heterozygosity；liver transplantation；diffuse hepatocellular carcinoma；clonal origin

R735.7

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.013

国家高技术研究发展计划（863）项目（2012AA021001）；国家自然科学基金面上资助项目（81470982）；天津市卫生行业重点攻关项目（13KG103）；天津市卫生局科技基金项目（2014KZ028）

1天津医科大学一中心临床学院（邮编300192）；2天津市第一中心医院器官移植中心；3天津市器官移植重点实验室；4卫生部危重病急救医学重点实验室

张鲁洲（1989），男，硕士在读，主要从事肝肿瘤研究

∆E-mail：zhenghongxy@163.com