Apelin-13对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用

董昕，陆素青，廖慧颖，欧阳新平，李国术，周洁

专题研究·缺血再灌注损伤

Apelin-13对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用

董昕1，陆素青2，廖慧颖1，欧阳新平3，李国术4，周洁5△

目的 观察Apelin-13对大鼠脑缺血-再灌注损伤（CIRI）的保护作用并探讨其机制。方法 50只SD雄性大鼠随机分为假手术组、CIRI模型组及低剂量（0.1 μg/kg）、中剂量（1.0 μg/kg）和高剂量（10.0 μg/kg）Apelin-13处理组。线栓法建立大鼠脑CIRI模型，在缺血2 h后再灌注72 h，Apelin-13处理组于再灌注前30 min侧脑室注射Apelin-13。对各组大鼠神经功能进行评分，TTC染色观察并计算脑梗死体积百分比，Western blot检测损伤侧大脑皮质中内质网应激标志蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和C/EBP同源蛋白（CHOP）的表达。结果 与假手术组比较，CIRI模型组大鼠神经功能评分显著增加（P＜0.05），脑梗死体积百分比达到（47.63±5.81）%；损伤侧大脑皮质中GRP78和CHOP的表达量显著升高（均P＜0.05）。与CIRI模型组相比，低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）；中剂量和高剂量Apelin-13处理组大鼠神经功能缺损明显改善，肌力明显增强，脑梗死体积百分比显著降低，损伤侧大脑皮质中GRP78和CHOP的表达显著降低（均P＜0.05）。结论 Apelin-13对大鼠CIRI有保护作用，其机制可能与抑制内质网应激有关。

Apelin-13；脑缺血-再灌注损伤；神经功能；脑梗死；内质网应激；葡萄糖调节蛋白78；C/EBP同源蛋白

脑血管疾病是造成人类死亡和残疾的三大疾病之一，其中缺血性脑血管病占70%左右［1］。脑缺血梗死后，再灌注会进一步加重脑损伤，导致脑缺血-再灌注损伤（CIRI）。CIRI的机制十分复杂，至今没有完全阐明［2-3］。Apelin是血管紧张素受体AT1相关受体蛋白（APJ）的天然配体［4］。研究发现Apelin与神经系统疾病的发生发展密切相关，是一种新型的神经保护因子［5-6］，但Apelin是否对CIRI具有保护作用尚不完全清楚。本研究拟观察Apelin-13对大鼠CIRI的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康SPF级雄性SD大鼠50只，体质量250～300 g，购自南华大学实验动物中心，以普通饲料喂养。通过随机数字表将大鼠分为5组：假手术组、CIRI组，Apelin-13低剂量（0.1 μg/kg）、中剂量（1.0 μg/kg）和高剂量（10.0 μg/kg）组，每组10只。生理盐水溶解Apelin-13，于再灌注前30 min通过右侧脑室进行注射。3个Apelin-13处理组注射量为30 μL/kg，假手术组和CIRI组给予相同剂量的生理盐水。

1.2 主要试剂 Apelin-13和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）购自美国Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司；葡萄糖调节蛋白78（GRP78）抗体、C/EBP同源蛋白（CHOP）抗体和β-actin抗体以及辣根过氧化物酶标记二抗购自美国Santa cruz公司；其他为国产分析纯。

1.3 动物模型制备 采用线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶性CIRI模型。在颈部正中切开皮肤，做正中切口，分离出右侧颈总动脉及颈内和颈外动脉，结扎颈外动脉。在颈总动脉上剪一小斜口，插入直径为0.28 mm、头端呈圆钝形的尼龙线，插入长度约20 mm，在大脑中动脉起始端堵塞动脉。将颈总动脉和尼龙鱼线一起结扎，缝合皮肤。在阻断血流2 h后，拔出尼龙鱼线实现血流再灌注72 h。假手术组只分离血管，不结扎动脉，不插入尼龙鱼线。大鼠苏醒后出现左侧肢体瘫痪，左上肢屈曲，站立不稳和行走时向左侧转圈等情况为模型成功。

1.4 侧脑室埋管与Apelin-13注射 10%水合氯醛按300 mg/kg剂量通过腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠固定在脑立体定位仪上，根据L J Pellegrine大鼠脑立体定向图谱，在相当于侧脑室的颅骨部位钻孔埋入插管套管，具体位置为大鼠矢状缝和冠状缝愈合处向后3～4 mm，中缝向右1～2 mm，插管深度为3 mm，使用牙托粉将插管固定。用微量注射器通过套管注射相应剂量的Apelin-13，给药3 min，留针1 min后再拔出注射器。

1.5 神经功能评分 采用神经损伤严重缺损评分系统（NSS）分别于再灌注后6、12、24、48和72 h对各组大鼠进行评分［7］。评分标准：无明显神经功能缺损记为0分；左前肢伸展障碍记为1分；行走时向左侧转圈记为2分；行走时向左侧倾倒记为3分；不能自发行走，意识丧失，昏迷记为4分；动物死亡记为5分。CIRI模型大鼠的评分为0分、4分和5分的均被剔除。剔除的大鼠在后续实验中补充。

1.6 TTC染色观察脑组织梗死体积 再灌注72 h后处死大鼠，在冰上迅速取出脑组织。每组选取5只大鼠脑组织置于-20℃快速冷冻20 min，以2 mm左右间隔自额叶向枕叶切成5个冠状切片，将脑切片放入1%TTC染液中，37℃染色20 min，4%多聚甲醛中固定6 h，数码相机拍照。Image-proplus 6.0软件对每个脑片进行测量和分析，三维成像后再计算脑梗死体积与全脑体积的百分比。

1.7 Western blot检测GRP78和CHOP表达 取每组剩下的5只大鼠损伤侧大脑皮质组织，提取组织总蛋白。BCA法测量蛋白浓度。取100 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转膜。10%脱脂牛奶室温封闭2 h后加入兔抗鼠GRP78 （1∶300）和CHOP（1∶200），4℃过夜，以β-actin作为内参。加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶400），室温孵育2 h。蛋白印迹荧光检测试剂盒显示于X线片，经显影、定影后，Labworks图像分析系统对结果进行灰度扫描，采用目的基因与内参基因灰度值的比值进行半定量分析。

1.8 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，计量资料以±s表示，5组间总体趋势比较采用析因设计方差分析，均数比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组神经功能比较 同组大鼠神经功能评分在4个时间点的变化趋势不全相同（F=27.536，P＜0.01），同一时间点5组大鼠神经功能评分不全相同（F=21.817，P＜0.01），时间与处理因素有交互作用（F=16.043，P＜0.01），即5组大鼠在4个时间点神经功能评分的变化趋势不全相同。CIRI组大鼠均出现神经功能缺损症状，主要表现为内收肌力下降，前肢屈曲，左上肢屈曲，左侧肢体瘫痪，站立不稳，行走时向左侧转圈。CIRI组各时间点神经功能评分与假手术组相比显著升高（均P＜0.05），于再灌注后24 h达到高峰；与CIRI组相比，Apelin-13中、高剂量组的神经功能缺损明显改善，肌力明显增强，各时间点神经功能评分均显著降低（均P＜0.05）；假手术组大鼠均没有出现上述表现，神经功能评分记为0分，见表1。

2.2 各组大鼠脑梗死体积比较 假手术组大鼠脑组织呈现均匀一致的红色，没有发现梗死区域。CIRI组可见右侧脑组织大小不一致的苍白色梗死区域，而左侧脑组织无梗死区域，见图1。再灌注72 h CIRI组大鼠脑梗死比例达到（47.63±5.81）%，Apelin-13中、高剂量组大鼠脑梗死比例与CIRI组比较显著降低（均P＜0.05）；而低剂量组与CIRI组比较差异无统计学意义，见表2。

2.3 各组GRP78和CHOP表达水平比较 与假手术组相比，CIRI组大鼠损伤侧皮质GRP78和CHOP蛋白表达增高（P＜0.05）。与CIRI组相比，Apelin-13中、高剂量组大鼠损伤侧皮质GRP78和CHOP蛋白表达均降低（均P＜0.05），与低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05），见图2、表2。

Tab.1 Comparison of the neural function scores between five groups表1 各组大鼠神经功能评分比较 （n=10，±s）

Tab.1 Comparison of the neural function scores between five groups表1 各组大鼠神经功能评分比较 （n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与（1）比较，b与（2）比较，c与（3）比较，d与（4）比较，P＜0.05；表2同

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Fig.1 Comparison of the brain injury of rats between five groups （TTC staining method，the third coronal section was showed in the figure）图1 各组大鼠脑组织损伤比较（TTC染色，第三冠状切片）

Tab.2 Comparison of percentage of infarct volume and expressions of GRP78 and CHOP between five groups表2 各组大鼠脑梗死体积百分比及GRP78和CHOP表达水平比较

3 讨论

冠状动脉粥样硬化引起的心肌梗死、脑梗死等缺血损伤是导致患者死亡的常见病因。CIRI增加了脑缺血性疾病的病死率和致残率，严重威胁着人类的健康。寻找安全有效防治CIRI的方法已成为神经科医生关注的焦点问题。

Fig.2 Comparison of expressions of GRP78 and CHOP between five groups图2 各组GRP78和CHOP表达水平比较

Apelin是一种小分子的内源性多肽，其基因定位于人染色体的Xq 25～26.3，包含有2个内含子和3个外显子。Apelin前蛋白原包含有77个氨基酸，其羧基末端含有与APJ特异性结合的区域［8］。Apelin的羧基末端富含碱性氨基酸残基（主要包括精氨酸和赖氨酸），是蛋白水解酶的酶切位点。蛋白水解酶可将Apelin前体肽水解为长度不同的多肽片段，包括Apelin-12、Apelin-13、Apelin-17和Apelin-36等，其中Apelin-13在神经系统的表达水平较高，与神经系统的关系密切［9］。Apelin及APJ在神经元的胞体和神经纤维中均有大量的表达，而在突触中的表达水平相对较低［10］。

研究表明，Apelin具有神经保护作用，能对抗兴奋性神经毒性及氧化应激损伤，抑制神经细胞的凋亡等，是一种内源性神经保护因子［5-6］。Apelin/APJ系统也与多种神经系统疾病密切相关，有望成为神经系统疾病治疗的新靶点。研究发现，Apelin-13通过侧脑室给药，可显著减轻脑水肿的程度［11］。通过侧脑室注射和海马微注射Apelin-13均能剂量依赖性地抑制小鼠长期记忆功能，其机制与Apelin抑制小鼠海马区的ERK磷酸化水平有关［12］。在癫痫患者颞叶皮质脑组织中Apelin的表达显著增加，而氯化锂-匹罗卡品诱导的大鼠癫痫模型海马中，Apelin的表达在癫痫发作期逐渐增加，在慢性癫痫期达到最高水平［13］。此外，Apelin还可通过抗氧化应激抑制肌萎缩性侧索硬化症的进展［14］。本研究结果显示，Apelin-13改善了CIRI模型大鼠的临床症状，使肌力增强，神经功能评分和脑梗死体积百分比明显降低，表明Apelin-13保护了CIRI，可能是防治CIRI的有效途径。

内质网是真核生物细胞中参与蛋白质的合成、折叠与分泌等功能的重要细胞器。内质网应激（ERS）是指由于某种致病因素所导致的细胞中内质网生理功能紊乱的一种亚细胞器病理状态。内质网中内环境的稳态是保证其功能的前提条件，致病因素可引起内质网中内环境稳态的破坏，导致ERS，这些因素包括氧化应激、缺血-再灌注损伤、同型半胱氨酸水平升高、细胞内蛋白质合成过快而超过了内质网蛋白折叠能力、细胞中卵磷脂代谢障碍以及内质网中钙代谢的紊乱等［15］。GRP78是热休克蛋白70家族的成员之一，在蛋白质的折叠、分泌和转运过程中以及ERS中发挥着核心作用，是ERS的标志性蛋白［16］。CHOP又称生长停滞及DNA损伤诱导蛋白153（GADD153），是一个特异性的ERS转导因子，是GRP78重要的下游信号分子。CHOP主要在细胞的细胞浆中表达，而且正常情况下其表达的水平相对较低，但当细胞处于应激状态时，CHOP的表达水平明显增加。有研究显示在持续的ERS中CHOP高表达可促进细胞的凋亡［17］。本研究显示Apelin-13降低了CIRI大鼠损伤侧皮质中GRP78 和CHOP的表达，表明Apelin-13可能抑制了CIRI大鼠损伤侧皮质中的ERS。

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（2014-10-28收稿 2014-12-02修回）

（本文编辑 胡小宁）

Apelin-13 protects the cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

DONG Xin1，LU Suqing2，LIAO Huiying1，OUYANG Xinping3，LI Guoshu4，ZHOU Jie5△
1 Department of Internal Neurology，The First Affiliated Hospital，University of South China，Hunan 421001；2 Department of Nuclear Medicine，The Affiliated Hospital，Guilin Medical College；3 Department of Physiology i.e.Institute of Neuroscience，Medical College，University of South China；4 Department of Emergency，Hengyang Central Hospital；5 The 169th Hospital of the Chinese People's Liberation Army
△Corresponding Author E-mail:zhoujie7927@126.com

Objective To observe the protective effect of Apelin-13 on the cerebral ischemia-reperfusion injury （CIRI），and to explore the possible mechanism in rat model.Methods Fifty male SD rats were randomly divided into five groups:sham group，CIRI model group and Apelin-13（0.1，1.0 and 10.0 μg/kg）treatment groups.The model of CIRI was established by filament.After 2 h ischemia，the focal middle cerebral artery was followed by 72 h reperfusion.Apelin-13 was administrated by intracerebroventricular injection 30 minutes before reperfusion.The score of neural function was estimated in different time points.The 2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride（TTC）dye was used to calculate the volume and percentage of cerebral infarction.The endoplasmic reticulum stress（ERS）protein markers including glucose-regulated protein 78 （GRP78）and CCAAT/enhancer binding protein homologous protein（CHOP）in cerebral cortex were measured by Western blot assay.Results Compared with the sham group，the score of neural function was significantly increased，the infarct rate was reached（47.63±5.81）%and the protein expressions of GRP78 and CHOP were significantly up-regulated in CIRI model group（P＜0.05）.There were no significant differences in these data between the CIRI model group and 0.1 μg/kg Apelin-13 treatment group（P＞0.05）.Compared with the CIRI group，the neural function defect was significantly improved，the muscle strength was significantly enhanced and the infarct rate was significantly decreased，and the protein expressions of GRP78 and CHOP were significantly down-regulated in the 1.0 and 10.0 μg/kg Apelin-13 treatment groups（P＜0.05）.Conclusion Apelin-13 protects the cerebral ischemia-reperfusion injury in rat model，which may be related with the inhibition of endoplasmic reticulum stress.

Apelin-13；cerebral ischemia-reperfusion injury；nerve function；cerebral infarction；endoplasmic reticulum stress；glucose-regulated protein 78；CCAAT/enhancerbinding protein homologous protein

R743

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.010

国家自然科学基金项目（81171281、81300158）；湖南省研究生科研创新项目（CX2014B393）；衡阳市科技局课题（2013KS25）

1南华大学附属第一医院神经内科（邮编421001）；2桂林医学院附属医院核医学科；3南华大学医学院生理学教研室、神经科学研究所；4衡阳市中心医院急诊科；5解放军第一六九医院

董昕（1978），硕士，主治医师，主要从事脑血管疾病防治研究

△E-mail:zhoujie7927@126.com