AG490对重症急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡细胞凋亡的影响

付金鹏，宋宝骥，肖元廷

AG490对重症急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡细胞凋亡的影响

付金鹏，宋宝骥△，肖元廷

目的 探讨AG490对重症急性胰腺炎（SAP）大鼠胰腺腺泡细胞凋亡及凋亡基因FasL和Bcl-2表达的影响。方法 健康Wistar大鼠72只，按随机数字表法分为对照组（24只）、SAP模型组（24只）和AG490治疗组（24只）。后2组采用5%牛磺胆酸钠胆胰管内逆行注入诱导SAP大鼠模型，3组大鼠均于术后6 h、12 h、24 h心脏采血，检测血清淀粉酶。剖腹取胰腺组织，光镜下观察胰腺组织病理改变并进行病理学评分，TUNEL法检测胰腺腺泡细胞凋亡指数，RT-PCR检测胰腺组织FasL、Bcl-2 mRNA的表达。结果 与对照组比较，SAP模型组大鼠胰腺病理损伤加重，病理评分增高，血清淀粉酶明显升高，胰腺腺泡细胞凋亡指数升高，FasL mRNA表达明显升高，Bcl-2 mRNA表达明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。与SAP模型组相比较，AG490治疗组大鼠胰腺病理损伤明显改善，病理评分降低，血清淀粉酶明显降低，胰腺腺泡细胞凋亡指数升高，FasL mRNA表达明显升高，Bcl-2 mRNA表达明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。结论 抑制JAK/STAT3信号通路可能通过调节凋亡相关基因，增加胰腺腺泡细胞凋亡，从而减轻胰腺炎症反应及病理损害。

胰腺炎；急性病；蛋白酪氨酸激酶类；胰腺；细胞凋亡；基因；配体；基因，bcl-2；AG490；FasL

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是以胰腺弥漫性出血和组织坏死为特征、累及全身多个脏器的危急重症，病情凶险，病死率高达10%～24%［1］。在胰腺炎发生发展过程中伴随大量炎性介质的释放，这些炎性介质可以促进胰腺腺泡细胞凋亡或细胞坏死。JAK/STAT途径作为重要的炎症反应信号通路，在炎症反应途径中起重要调节作用。早期阻断JAK/STAT信号通路可在一定程度上缓解SAP炎症反应［2］，但其对胰腺腺泡细胞凋亡的影响鲜有报道。本文旨在通过建立SAP模型，观察JAK2特异性抑制剂AG490对SAP大鼠胰腺腺泡细胞凋亡的影响，从而为临床治疗SAP提供新的实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 AG490购自美国Sigma公司，牛磺胆酸钠购自北京奥博星生物技术责任有限公司，健康Wistar大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司［许可证编号：SCXK（京）2007-0001］，引物设计和合成购自上海生工生物工程技术服务有限公司，TUNEL法细胞原位凋亡检测试剂盒购自德国Roche公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒购自美国Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 动物和模型制备 Ⅰ级Wistar大鼠72只，体质量230～300 g，雌雄各半，应用随机数字表将大鼠随机分为对照组（24只）、SAP模型组（24只）和AG490治疗组（24只）。后2组采用5%牛磺胆酸钠胆胰管内逆行注入的方法诱导SAP大鼠模型。大鼠术前禁食不禁水12 h，AG490治疗组于造模前30 min腹部皮下注射8.0 mg/kg AG490。麻醉满意后固定大鼠，无菌条件下取剑突下0.5～1.0 cm上腹正中切口入腹。对照组开腹后翻动胰腺数次；SAP模型组和AG490治疗组，使用连接微量注射泵的一次性静脉留置套管针于胆胰管开口处的十二指肠对系膜缘的肠壁进行穿刺，进入肠腔后即将针芯退出，将套管经胆胰管开口处逆行插入胆胰管约1.0 cm，以无损伤小动脉夹于肝门部阻断胆总管后，以0.1 mL/min的速度匀速注入5%牛磺胆酸钠（1 mL/kg）。注毕5 min后拔管，去除小动脉夹，以无水乙醇棉签处理肠壁穿刺处，回纳十二指肠后关腹。

1.2.2 标本采集和保存 3组大鼠均于术后6 h、12 h、24 h麻醉后心脏采血，室温放置1 h待自然凝固后，于4℃3 000 r/min离心10 min获得血清，冻存于-20℃备测淀粉酶。取血后剖腹，切取胰尾部组织，液氮保存以备总RNA及蛋白提取。取病变较为一致的胰头部组织置10%福尔马林溶液中固定，4 μm连续切片供HE染色、TUNEL凋亡细胞检测。

1.2.3 血清淀粉酶测定 采用全自动生化分析仪检测。

1.2.4 胰腺组织病理学评分 胰腺组织标本常规制作病理石蜡切片，HE染色，在光镜下比较胰腺病理组织学改变，同时按照镜下病理评分标准［3］由病理科医师进行双盲评分。

1.2.5 胰腺细胞凋亡检测 采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测，操作严格按照说明书进行。以双蒸水代替TDT作阴性对照，DNAase处理的切片作阳性对照，细胞凋亡阳性结果表现为胞核染成棕褐色，胞核固缩、空泡化，染色质浓缩、边聚，凋亡小体形成。于每张切片中选取10个高倍视野（400倍），分别计数凋亡细胞数和总细胞数，计算凋亡指数（AI）=凋亡细胞数/总细胞数× 100%。

1.2.6 RT-PCR检测胰腺组织中 FasL、Bcl-2 mRNA的表达 Trizol一步法提取胰腺组织总RNA，并逆转为cDNA（日本宝生物试剂盒），荧光定量PCR反应条件（美国Bio-Rad公司荧光定量PCR仪）：95℃5 min，95℃45 s，57℃45 s，72℃60 s，35个循环；末循环72℃10 min。引物序列：FasL上游5′-CCAGGACAAAGGAGACC-3′，下游5′-GGGTTG GCTATTTGCTT-3′，扩增产物长度 275 bp；Bcl-2上游 5′-GGCATCTTCTCCTTCCAG-3′，下游5′-ATCCCAGCCTCCGTTAT-3′，扩增产物长度441 bp；β-actin上游 5′-TGACG GGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′，下游5′-CTAGA AGCATTGCGGTGGACGATGGAGGG-3′，扩增产物长度666 bp。

1.3 统计学方法 实验数据应用SPSS 13.0统计软件进行分析。定量资料经Kolmogorov-Smirnov检验分析，均呈正态分布，其数值以均数±标准差（x ±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠血清淀粉酶变化 与对照组相比，各时间点SAP模型组血清淀粉酶明显升高，与SAP模型组相比，AG490治疗组各时点的血清淀粉酶明显降低（P＜0.01），见表1。

Tab.1 Comparison of the serum levels of amylase in three groups表1 3组大鼠血清淀粉酶水平比较（n=24，U/L，x±s）

2.2 3组大鼠胰腺组织病理学改变及病理评分 对照组各时相胰腺组织正常，伴或不伴间质轻度水肿，无出血及炎症细胞浸润，见图1。SAP模型组6 h镜下见胰腺小叶间充血、水肿，伴有少量的炎症细胞浸润，小叶结构完整，伴轻度局限点状坏死，无出血；12 h见小叶间明显充血水肿、炎症细胞浸润增多，伴有点状坏死和出血，可见凋亡小体形成；24 h见腺泡张力高、广泛分隔小叶，小叶正常结构破坏、丧失，实质广泛出血、血管扩张，实质小片状脂肪变性、坏死明显，大量炎症细胞浸润，见图2。AG490治疗组6 h镜下见间质轻度水肿，少量炎症细胞浸润；12 h见胰腺小叶间充血、水肿，少量炎症细胞浸润，小叶结构尚完整，有局限点状坏死，无出血；24 h见小叶间明显充血水肿、炎症细胞浸润增多，部分小叶正常结构破坏、丧失，伴有点状坏死和出血，有凋亡小体形成，见图3。SAP模型组病理学评分高于对照组和AG490治疗组，差异有统计学意义，见表2。

Fig.1 Pancreas image of control group（HE staining，×200）图1 对照组胰腺（HE染色，×200）

Fig.2 Pancreas image of SAP model group（HE staining，×100）图2 SAP模型组胰腺（HE染色，×100）

Fig.3 Pancreas image of AG490 treatment group（HE staining，×100）图3 AG490治疗组胰腺（HE染色，×100）

Tab.2 The pathological scores of pancreatic tissues in three groups表2 3组大鼠胰腺组织病理学评分 （n=24，x±s）

2.3 3组大鼠胰腺细胞凋亡检测 SAP模型组胰腺细胞凋亡指数高于对照组，低于AG490治疗组，差异有统计学意义，见表3。

Tab.3 The apoptosis index of pancreatic acinar cells in three groups表3 3组大鼠胰腺细胞凋亡指数水平（n=24，%，x±s）

2.4 3组大鼠胰腺组织FasL mRNA的表达 SAP模型组胰腺组织FasL mRNA表达高于对照组，低于AG490治疗组，差异有统计学意义，见表4。

Tab.4 The changes of FasL mRNA expression in pancreatic tissue in three groups表43 组胰腺组织FasL mRNA的表达变化（n=24，x±s）

2.5 3组大鼠胰腺组织Bcl-2 mRNA的表达 SAP模型组胰腺组织Bcl-2 mRNA表达低于对照组，高于AG490治疗组，差异有统计学意义，见表5。

Tab.5 The changes of Bcl-2 mRNA expression in pancreatic tissue in three groups表53 组胰腺组织Bcl-2 mRNA的表达变化（n=24，x±s）

3 讨论

急性胰腺炎是外科常见急腹症之一。其发病机制尚未阐明。既往研究认为，急性胰腺炎时，在损伤因子（如异常激活的胰酶）作用下，单核（巨噬）细胞被激活并释放多种细胞因子，炎症反应失控，促炎细胞因子大量释放，导致全身炎症反应综合征（SIRS），引起自身细胞和组织损伤，进而损伤多器官功能而致多器官功能不全（MODS），甚至死亡。JAK/STAT途径作为重要的炎症反应信号通路，在炎症反应途径中起重要调节作用。JAK2和STAT3作为该家族中的重要成员，在细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等过程中发挥着重要作用［4-5］。目前已发现多种细胞因子，包括肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、IL-1β、核因子（NF）-κB等，它们通过激活JAK/STAT信号转导通路，在炎症反应的发生、发展过程中发挥作用［6］。JAK2/STAT3信号通路的激活可诱导IL-6及IL-18过度表达，可能加重SAP时的炎症反应和肺损伤［7］。早期阻断JAK/STAT信号通路可在一定程度上缓解SAP炎症反应［2］。应用JAK2特异性抑制剂AG490抑制该信号通路过度活化，可减少各种促炎因子的产生，从而有效改善胰腺局部及远处器官损伤［8］。本研究发现，与对照组相比，SAP模型组大鼠血清淀粉酶明显升高，胰腺病理损伤逐渐加重。与SAP模型组相比较，AG490治疗组大鼠血清淀粉酶明显降低，胰腺病理损伤明显改善。

现有研究表明，在急性胰腺炎起病初期，各类损伤因素损害胰腺腺泡细胞。如果胰腺腺泡细胞死亡以坏死方式为主，则引发炎症，继而触发白细胞系统和细胞因子网络的级联放大反应，损伤其他脏器，诱发多脏器功能衰竭，从而导致重症胰腺炎的发生。如果胰腺腺泡细胞死亡以凋亡方式为主，则不会引起严重的炎症反应和其他脏器损害，表现为轻型胰腺炎。有学者研究显示中药配方大承气汤能诱导体外和体内急性胰腺炎（AP）模型的腺泡细胞发生凋亡，并减少细胞坏死，其可能的机制是减少AP时腺泡细胞活性氧的产生并增加一氧化氮水平，使腺泡细胞的死亡方式从坏死向凋亡转换［9］。因此，早期应用药物干预，诱导胰腺腺泡细胞凋亡，已成为治疗急性胰腺炎的新研究课题。

细胞凋亡是受众多凋亡相关基因控制的程序性细胞死亡，其调控途径主要有细胞外死亡受体途径和细胞内线粒体途径。有研究发现Fas/FasL死亡受体凋亡途径介导了急性胰腺炎腺泡细胞凋亡，Fas基因缺失可明显加重蛙皮素诱导的鼠急性胰腺炎病情［10］。Bcl-2亚家族对细胞凋亡起抑制作用，其中Bcl-2控制着凋亡的一些共同通路。本研究发现，与对照组相比，SAP模型组大鼠胰腺腺泡细胞凋亡指数升高，FasL mRNA表达明显升高，Bcl-2 mRNA表达明显降低。与SAP模型组相比，AG490治疗组大鼠胰腺腺泡细胞凋亡指数明显升高，FasL mRNA表达明显升高，Bcl-2 mRNA表达明显降低。由此推测，AG490可能通过调节细胞凋亡相关基因，增加胰腺腺泡细胞凋亡，从而减轻胰腺炎症反应及病理损害。

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（2014-09-22收稿 2015-01-14修回）

（本文编辑 魏杰）

Effects of AG490 on the apoptosis of pancreatic acinar cells in rat model of severe acute pancreatitis

FU Jinpeng，SONG Baoji△，XIAO Yuanting
Tianjin Hospital，Tianjin 300211，China
△Corresponding Author E-mail:2802283789@qq.com

Objective To investigate the effect of AG490 on the apoptosis of pancreatic acinar cells and expression of apoptosis gene FasL and Bcl-2 in rat model of severe acute pancreatitis（SAP）.Methods Seventy-two healthy Wistar rats were randomly divided into control group（n=24），SAP group（n=24）and AG490 group（n=24）.Heart blood samples were taken to detect serum amylase at 6 h，12 h and 24 h after operation in three groups.Pancreatic tissue were observed under light microscope to analyze pathological changes and pathological scores.The index of pancreatic acinar cell apoptosis was detected by TUNEL.The expressions of FasL and Bcl-2 mRNA in pancreatic tissue was detected by RT-PCR.Results Compared with control group，the damage of pancreatic tissue was gradually increased，the serum level of amylase significantly increased（P＜0.01），the index of pancreatic acinar cell apoptosis increased，the expression of FasL mRNA was significantly increased，the expression of Bcl-2 mRNA was significantly decreased（P＜0.05 or P＜0.01）in SAP group.Compared with SAP group，the pancreatic injury was improved significantly，the serum amylase significantly decreased（P＜0.01），the apoptosis index rate of pancreatic acinar cells was increased，the expression of FasL mRNA was significantly increased，and the expression of Bcl-2 mRNA was significantly decreased（P＜0.05 or P＜0.01）in AG490 group.Conclusion The inhibition of the JAK/STAT3 signaling pathway may regulate the apoptosis-related gene to increase the apoptosis of pancreatic acinar cells，thereby reducing the reaction and pathological damages of acute pancreatitis.

pancreatitis；acute disease；protein-tyrosine kinases；pancreas；apoptosis；genes；ligands；genes，bcl-2；AG490；FasL

R657.5+1

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.009

天津医院普通外科（邮编300211）

△E-mail:2802283789@qq.com