Drosha在子宫内膜癌组织中的差异表达及临床意义

何中慧，徐红，况燕，徐文生，蒙玉刚，徐朝欢

Drosha在子宫内膜癌组织中的差异表达及临床意义

何中慧，徐红△，况燕，徐文生，蒙玉刚，徐朝欢

目的 探讨Drosha在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义。方法 应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot检测正常子宫内膜组织（25例）、不典型增生子宫内膜组织（20例）及子宫内膜癌组织（40例）中Drosha的表达，分析Drosha在子宫内膜癌组织中的表达与临床病理因素之间的关系。结果 子宫内膜癌组Drosha mRNA及蛋白表达水平均低于不典型增生子宫内膜组及正常子宫内膜组（均P＜0.05），不典型增生子宫内膜组及正常子宫内膜组的表达差异无统计学意义（均P＞0.05）。不同年龄、组织分级、病理分型、淋巴结转移、肌层浸润深度和FIGO分期的子宫内膜癌患者的Drosha mRNA表达差异无统计学意义（均P＞0.05）。结论 Drosha在子宫内膜癌组织中表达下调，可能与子宫内膜癌的发生发展有关。

子宫内膜癌；印迹法，蛋白质；Drosha；实时荧光定量PCR；临床病理特征

子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，严重威胁着女性健康［1］。Drosha是调控MicroRNAs（miRNAs）合成与成熟的关键酶，研究表明，Drosha在多种肿瘤中表达异常，对肿瘤的发生发展起重要作用［2-4］，但鲜见有关Drosha在子宫内膜癌中表达的报道。本研究旨在探讨Drosha在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义，为子宫内膜癌的分子诊断和靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2012年3月—2014年4月在广西医科大学第一附属医院进行手术治疗的子宫内膜癌患者的癌变内膜组织40例，以同期子宫内膜不典型增生的癌前病变内膜组织20例及因子宫肌瘤等良性病变行子宫切除术的正常子宫内膜组织25例作为对照。患者年龄30～67岁，中位年龄50岁。40例子宫内膜癌中病理组织分级：高分化（G1）20例，中分化（G2）11例，低分化（G3）9例；病理类型：子宫内膜腺癌30例，浆液性乳头腺癌5例，腺鳞癌5例；手术病理分期（FIGO，2000）：Ⅰ期24例，Ⅱ期6例，Ⅲ期10例；淋巴结转移5例，无淋巴结转移35例。所有标本均经病理科证实，术前均未经放化疗及激素治疗。标本均在手术切除后立即采集，液氮速冻，置于-80℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒购自美国Axygen公司；逆转录试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；荧光染料SYBR Green购自德国Roche公司；兔抗人Drosha多克隆抗体购自美国abcam公司；BCA蛋白定量试剂盒购自中国联科生物公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测 Drosha mRNA表达 取40 mg组织标本于液氮中研磨，依照RNA提取试剂盒说明书提取组织中总RNA，检测RNA浓度及纯度后按照逆转录说明将RNA逆转录为cDNA，以β-actin为内参，在LightCycler®480荧光定量PCR仪上进行检测。Drosha引物序列：上游5′-GGTGATGCTGTTGTTGAA-3′，下游5′-GTT⁃GCTAATCCTCCTTCTTC-3′。内参β-actin引物序列：上游5′-ACACTGTGCCCATCTACG-3′，下游5′-TGTCACGCAC⁃GATTTCC-3′。扩增体系20 μL：SYBR Green Master 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，RNA-free H2O 6 μL。反应条件：95℃5 min；95℃10 s，60℃1 min，72℃30 s，40个循环。qRT-PCR扩增结果采用2-ΔΔCt法分析Drosha基因的表达差异。

1.4 Western blot检测Drosha蛋白表达 取100 mg组织标本，加入单去污剂裂解液并超声匀浆，低温超速离心抽取组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。8%浓度的SDS-聚丙烯酰胺分离胶分离蛋白并将蛋白转至PVDF膜，封闭液封闭后加入兔抗人Drosha多克隆抗体（1∶5 000），4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000）室温孵育1 h后ECL化学发光观察，以GAPDH作为等量上样的标准，凝胶成像系统记录结果。Quantity One软件分析条带灰度值，蛋白表达相对量=Drosha条带灰度值/同一标本GAPDH条带灰度值。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行统计处理，计量资料采用±s表示，两样本均数的比较采用t检验；多组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Drosha mRNA及蛋白表达结果 子宫内膜癌组Drosha mRNA及蛋白表达水平均低于不典型增生组及正常内膜组（P＜0.05），而在不典型增生组和正常内膜组的表达差异无统计学意义，见图1、2。

2.2 子宫内膜癌组织Drosha mRNA表达与临床病理特征的关系 不同年龄、组织分级、病理分型、淋巴结是否转移、肌层浸润深度和FIGO分期的子宫内膜癌患者的Drosha mRNA表达差异无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

Fig.1 Comparison of transcription levels of Drosha mRNA in each group图1 各组间Drosha mRNA表达水平比较

Fig.2 Comparison of expression levels of Drosha protein in each group图2 各组间Drosha蛋白表达水平比较

Tab.1 Correlation between mRNA levels of Drosha with clinicopathological features of endometrial cancer表1 子宫内膜癌组织Drosha mRNA表达与临床病理特征的关系 （±s）

Tab.1 Correlation between mRNA levels of Drosha with clinicopathological features of endometrial cancer表1 子宫内膜癌组织Drosha mRNA表达与临床病理特征的关系 （±s）

均P＞0.05

临床病理特征年龄（岁）n t或F 1.685组织分级0.805病理分型＞50 ≤50 G 1 G 2 G 3子宫内膜样腺癌浆液性乳头状腺癌腺鳞癌19 21 20 11 9 30 1.848淋巴结转移 有无555 3 5 0.418肌层浸润深度0.210 FIGO分期≥1/2 ＜1/2Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期13 27 24 6 10 Drosha mRNA 0.67±0.42 0.80±0.47 0.80±0.45 0.78±0.36 0.59±0.38 0.69±0.45 0.70±0.29 1.09±0.48 0.71±0.45 0.98±0.34 0.62±0.39 0.80±0.46 0.77±0.44 0.74±0.55 0.68±0.43 0.143

3 讨论

MicroRNA（miRNA）是近年来发现的一类保守的小分子非编码RNA，通常在转录后水平调控基因表达；成熟miRNA通过降解靶mRNA或翻译抑制，对细胞增殖、分化及凋亡等生物学功能起着重要的调控作用［5］。近年研究表明，miRNA的异常表达与多种恶性肿瘤关系密切［6-8］。作为调控miRNA合成与成熟的关键因子，Drosha的异常改变影响miRNA的表达［9］，Drosha在肿瘤发生发展中的作用受到越来越多的关注。

本研究从mRNA及蛋白2个层面检测了Drosha在子宫内膜癌、不典型增生及正常子宫内膜组织的表达情况。结果显示子宫内膜癌组织、不典型增生子宫内膜组织及正常组织中均有Drosha的表达，但子宫内膜癌组的表达水平较正常内膜组和不典型增生组显著下降，提示Drosha参与了正常子宫内膜细胞的生长发育，可能在子宫内膜细胞中发挥抑癌基因的作用，具有潜在的辅助诊断价值。这一研究结果与Drosha在子宫内膜癌［10］、乳腺癌［11］、口腔癌［12］等恶性肿瘤中表达下调结果相一致。另有研究显示在结肠癌［13］及卵巢癌［14］中Drosha表达增高，考虑可能与Drosha在不同组织中的异质性表达及标本来源的地域性、人种的差异有关。

本研究结果显示，Drosha的表达与年龄、组织学分级、病理类型、淋巴转移、肌层浸润深度及FIGO分期等差异均无统计学意义。与乳腺癌［2］和口腔癌［12］的研究结果类似。值得注意的是，本研究中组织学上分化低、临床分期晚的子宫内膜癌的Drosha表达水平更低，下一步需要扩大样本数量，尤其是恶性程度高的子宫内膜癌，以更好了解其临床意义。

下调的Drosha可通过影响miRNA前体的加工，改变miRNA水平，促进肿瘤发生或转移。Lin等［15］发现在神经母细胞瘤细胞株中敲除Drosha能提高肿瘤细胞的增殖和转移能力。这可能是Drosha表达下调后促进肿瘤发生发展的重要机制之一，其调节通路有待深入研究发掘。

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（2014-09-12收稿 2014-11-22修回）

（本文编辑 胡小宁）

Clinical significance of differential Drosha expression between endometrial cancer tissue and other tissues

HE Zhonghui，XU Hong△，KUANG Yan，XU Wensheng，MENG Yugang，XU Chaohuan
Department of Gynecology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China
△Corresponding Author E-mail：nnxuhong@163.com

Objective To detect the different expressions of Drosha between endometrial cancer（EC）tissue and other tissues and to explore correlation between Drosha mRNA transcription level and protein expression level with clinicopatho⁃logical characteristics of EC.Methods The mRNA transcription and protein expression levels of Drosha were examinaned by q-PCR and Western blot respectively in normal endometrial tissues（25 cases），atypical hyperplasia of endometrial tis⁃sues（20 cases）and endometrial cancer tissues（40 cases）.Correlations between Drosha mRNA transcription and protein ex⁃pression with clinicopathological characteristics of EC were analyzed.Results The levels of Drosha mRNA and protein lev⁃els in EC were obviously lower than those in endometrial atypical hyperplasia and normal endometrium（P＜0.05）.But there is no significant difference of Drosha expression between endometrial atypical hyperplasia and normal endometrium tissues （P＞0.05）.The protein expression levels of Drosha were consistent with transcription of mRNA transcription levels.Drosha mRNA expression does not differ significantly with differentiation，histological type，myometrial invasion，lymphatic metasta⁃sis and FIGO stages of EC（P＞0.05）.Conclusion The expression levels of Drosha in EC tissues were down-regulated，therefore the reduction of Drosha may contributed to tumorigenesis of EC.

endometrial cancer；blotting，Western；Drosha；quantitative real-time polymerase chain reaction；clinico⁃pathological feature

R737.33

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.013

广西科技攻关计划项目（1298003-2-2）

广西医科大学第一附属医院妇科（邮编530021）

何中慧（1981），主治医师，硕士，主要从事妇科疾病及妇科肿瘤研究

△E-mail:nnxuhong@163.com