IME-FICC 法联合流式细胞仪检测膀胱癌患者外周血微转移的临床意义

江伟凡，熊建华

（南昌大学第二附属医院泌尿外科，南昌 330006）

膀胱癌是泌尿系统恶性肿瘤中最为常见的一种，90%以上的患者病情属于膀胱移行细胞癌，且20%左右为浸润癌。浸润癌患者的复发率及转移率相对较高，实际生存率较低，即使通过化疗、放疗、手术等方法对原发肿瘤与实体转移灶进行治疗，存在淋巴结转移或远处转移者在5年内的生存率也仅仅能够达到5%左右。如何早期发现和诊断膀胱癌是否发生转移是目前迫切需要解决的难题。本研究应用免疫磁珠阴性富集技术结合免疫荧光细胞化学技术（IME-FICC）检测膀胱癌患者外周血循环肿瘤细胞，联合应用多参数流式细胞仪方法（FCM）检测膀胱癌患者外周血CD105、CD146，探索一种早期发现膀胱癌患者外周血微转移的方法。

1 资料和方法

1.1 一般资料

收集2013年1月至2014年6月南昌大学第二附属医院泌尿外科经病理检查证实的膀胱癌患者60例作为研究组，健康志愿者15例作为对照组。所有研究对象抽血前均没有化疗、放疗及免疫等治疗史，没有其他系统恶性肿瘤病史或同时合并其他系统恶性肿瘤病史。按各自设定标准分别纳入研究对象。研究组中男46例，女14例；年龄35～77岁，平均年龄51岁；对照组中男9例，女6例；年龄34～52岁，平均年龄41岁。所有研究对象签署知情同意书、并经院伦理委员会讨论通过。

1.2 研究方法

所有研究对象在入院后，晨起空腹状态下，采集7.5mL静脉血于抗凝管中。留取血液标本200μL，通过FCM检测方式测定外周血CD105、CD146水平。剩余的血液标本采用IME-FICC检测外周血循环肿瘤细胞（CTC）。

1.2.1 IME-FICC检测

采集的血液应在48h内完成CD45免疫磁珠阴性富集。

1）细胞分离：①去除血浆蛋白及脂类：将标本转至干燥的50mL离心管，离心后可见明显分层，用电动负压吸引器吸去上层清夜，保留含沉淀及余液7.5mL；②溶解红细胞：依次加AS2及AS3液，离心2次后取上清液，保留余液（含白色沉淀）约5mL；③洗涤细胞：再次加AS1液，离心后保留余液（含白色沉淀）约1mL。

2）去除白细胞：取表面结合抗白细胞抗原（CD45）的抗体的磁珠颗粒进行阴性富集。

3）细胞固定：将混匀的含细胞液加至已经包被玻片的中央环加样区，温室静置1～2h，用记号笔标记细胞区，待玻片干燥后进行染色或置于玻片盒-80℃保存。

1.2.2 细胞化学染色

1）打孔：将干燥玻片置于TBS液中5min，再将玻片置于0.1%TritonX-100中5min，目的是增加细胞通透性。2）抗原固定：将玻片用PBS清洗3次。然后浸浴于2%多聚甲醛中40min，目的是固定抗原，之后用TBS清洗3次，洗毕用滤纸吸去多余水分。3）抗体孵育：暗室中，在玻片上滴加抗CD45抗体／抗CK20／0.2%BSA荧光抗体。4）清洗：分别用0.2%BSA和TBS清洗3次。5）显色：在细胞区内加入7μL荧光计数液（含DAPI），最后加盖玻片固定封片，之后即可在显微镜下计数或4℃保存（时间不超过3d）。

1.2.3 CTC的判定标准及阳性意义

1）形态学：①细胞呈圆形、椭圆形或长型，细胞长径大于10μm；②荧光下细胞形态及边缘完整；③光镜下可见完整细胞形态及细胞核。2）免疫荧光阳性标准：CK20+、CD45-、DAPI+。结果判定：由两位经培训实验员在荧光显微镜下分别观察细胞显色情况，按照以上标准采集阳性细胞图像、计数。3）阳性界定值：本课题以见到CTC，即≥1为阳性结果。

1.2.4 FCM检测

1）取血液标本200μL，各加入实验组和对照组流式管内100μL，CD45、CD105及CD146抗体标记，设同型对照组。2）破红细胞膜依次加入破红液A液600μL，及破红液B液200μL，离心后，去上清液，剩余为有核细胞，加PBS缓冲液500μL，震荡2s，使细胞混匀，待上机检测。3）流式细胞仪测定：采用CD45设门方法获取105个细胞，以CD45-CD105+CD146+细胞为阳性细胞，计数阳性细胞的数目，判定结果。凡≥8判定为阳性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行分析。计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

研究组患者的外周血CK20、CD105／CD146阳性率均明显高于对照组（P＜0.05）。详见表1。

表1 2组外周血CK20、CD105／CD146阳性率比较

3 讨论

原发肿瘤发生脱离之后进入到患者机体循环系统的肿瘤细胞是实体肿瘤在远处部位发生转移的一个必要条件[1]。血液循环系统中存在的肿瘤细胞具有与原发瘤细胞相同的细胞学和基因遗传学特征[2]。从患者外周血经过分离后得到的循环肿瘤细胞接种到试验小鼠机体之后可以在接种的部位和远隔器官产生转移病灶，证明循环肿瘤细胞具有较强的转移潜能[3]。

如何早期发现和诊断肿瘤是否发生转移是目前迫切需要解决的难题。近年来临床上相关的肿瘤免疫学、肿瘤生物化学、酶学及肿瘤分子生物学研究结果充分提示上皮性恶性肿瘤在侵袭和转移发生的早期阶段就可能有癌细胞进入血液循环中形成循环肿瘤细胞（CTC），即微转移。因此如何准确发现肿瘤微转移成为当前的研究热点之一。

在人体血液中存在的大量各类血细胞相比较，脱落至外周血液中的肿瘤细胞数目相对稀少，形态表现各异，分离、富集、鉴定难度较大。随着近年来免疫磁珠、多色荧光标记、流式细胞仪等技术的发展，使得分离、富集血液中的肿瘤细胞成为可能[4]。免疫磁珠分离技术（Immunomagnetic beads separation techniques，IMBS）是研究较多的新型免疫学技术的一种[5]。磁珠的富集方法可以分为正性富集和负性富集两种类型，且各有优劣[6]。本次研究中主要采用负性富集方式进行，其基本原理是将患者血液中其他细胞除去，剩余细胞即为包含CTC在内的全部稀有细胞，再对其实施鉴定。应用负性富集方法富集的CTC不会受肿瘤细胞表达上皮抗原量多少产生的影响，只需将外周血中大部分白细胞去除。

外周血进行富集之后的鉴定CTC的步骤是本课题的重要环节。临床上对实体瘤CTC进行鉴定的方法总体而言可以分为检测核酸和细胞形态学辨别两种。前者是对在肿瘤细胞和血液成分中差异表达的DNA或RNA情况进行检测；后者主要是采用细胞形态染色法或免疫细胞化学法对肿瘤细胞进行鉴定。本次研究中采用的是免疫荧光结合细胞形态的方法对CTC进行鉴定，具体的评判标准为：CK20染色显示为阳性，CD45染色显示为阴性；细胞核DAPI显示为阳性。

CK20是细胞角蛋白的一种，具有严格的上皮组织特异性，CK20在上皮源性的肿瘤中存在明显的表达，而外周血、骨髓、淋巴组织中没有任何表达。表达具有较高组织特异性，CK20是对肿瘤疾病进行诊断的一个有价值的指标。已经播散到血液循环中的恶性肿瘤细胞仍然能够继续表达原组织细胞的特异性，故通过对外周血CK20表达情况进行测定，即可对血液循环中膀胱肿瘤细胞的存在情况有充分的了解，对膀胱癌微转移的判断具有一定的帮助作用。

CD105对血管生成期间小血管内皮细胞染色的敏感性较高，在肿瘤组织增殖状态较为活跃的内皮细胞中呈现高表达，但在大多数正常组织中没有任何表达[7]。有研究[8]发现，直肠癌、乳腺癌等实性肿瘤发生转移的患者血清S-CD105的表达水平显著高于未发生转移的患者，从而提出血清S-CD105作为血管生成的标志，可以用来预测恶性肿瘤患者疾病复发、转移的危险性。所以CD105高表达可以作为对恶性肿瘤病灶转移和预后情况进行判断的一个重要指标。

CD146是Ca2+非依赖性细胞黏附分子的膜糖蛋白类物质的一种，属于免疫球蛋白超家族中的一个主要成员，对细胞与细胞之间或细胞与细胞外基质之间的相互作用进行介导，对局部黏连聚集、细胞骨架重组、细胞间相互作用、细胞形态的维持及细胞游走和增殖的调控具有一定的帮助作用。目前临床观点认为肿瘤发生转移需要肿瘤细胞能够顺利进出血管系统，肿瘤中CD146阳性血管内皮可以与肿瘤细胞上存在的CD146受体发生结合反应，从而参与到肿瘤细胞进出血管系统的过程中。另外由CD146介导形成的肿瘤细胞簇对肿瘤细胞间的作用和肿瘤细胞的生长可以产生一定的帮助[9]。有研究[10]结果表明CD146对内皮细胞的黏附、增殖、迁移过程具有促进作用，充分提示其在血管新生过程中起重要作用。

本课题在已有的研究基础上，结合国内外关于肿瘤微转移最新研究进展，应用IME-FICC检测膀胱癌患者外周血循环肿瘤细胞，联合FCM检测膀胱癌患者外周血血管内皮细胞的特异性标志物CD105、CD146具有较高的敏感性。为膀胱癌微转移的早期诊断提供新的思路和理论依据。

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