木瓜蛋白酶在[Cnmim]BF4-NaH2PO4双水相体系中的分配行为

蔡涛，张海德，董安华，彭健，吴蕊，朱英瑞

（海南大学食品学院，海南 海口 570228）

引 言

双水相体系（aqueous two-phase system，ATPS）是指某些亲水性的高分子聚合物与聚合物或聚合物与无机盐溶解在水中，超过一定浓度时能自然地分成互不相溶的两相或多相的体系[1]。该体系具有操作简单、条件温和等特点，已广泛应用于核酸、蛋白质和病毒等生物产品的分离纯化[2-4]，是一种很有前景的新型分离技术。

离子液体，又称室温熔融盐，是指在室温或者接近室温的情况下完全由有机阳离子和无机或有机阴离子组成的熔盐体系[5]。离子液体具有其他常规溶剂无可比拟的优点[6-10]，如不挥发、无色、无臭、溶解能力强、蒸气压极低、化学稳定性好和通过正负离子可设计目标离子液体等。离子液体双水相体系（ionic liquids aqueous two-phase system，ILATPS）通常由一种有机盐（亲水性离子液体）、一种无机盐（如磷酸盐、碳酸盐、氢氧化物等）和水形成，该双水相体系综合了离子液体和双水相体系的优 点[11-12]，开辟了新的萃取分离体系。但是，对于离子液体双水相系统的形成机理和目标物质在其中的分配行为及规律缺乏理论解释。

近年来，对离子液体双水相体系的研究十分活跃。王伟涛等[13]用[C4mim]Cl/K2HPO4提取木瓜蛋白酶并对其做了系统优化，木瓜蛋白酶的酶活性回收率可达到91.2%，纯化因子可以达到1.73。邓凡政等[14]用[Bmim]BF4/NaH2PO4体系对牛血清蛋白 提纯，结果表明萃取率可达到99%。Du 等[15]用[Bmim]Cl/K2HPO4体系对尿液中的蛋白质提纯，结果表明，分配系数可达到10，富集因子为5。Ruiz-Angel 等[16]用[Bmim]Cl/K2HPO4体系对卵清蛋白提纯，结果表明分配系数可高达180。王军等[17]用[Nebm]BF4/KH2PO4体系对α-淀粉酶提纯，结果表明回收率可达到98.5%。董安华等[1]用PEG-硫酸铵组成的双水相进行了相平衡数据的关联，并建立了木瓜蛋白酶在该体系中的分配模型，数据关联度较高。

离子液体双水相成相能力的大小与离子液体在水中的溶解性和无机盐的盐析作用有关，溶解性越差成相能力越强，盐析作用越弱越不利于分相，研究表明 [Cnmim]BF4较[Cnmim]Cl、[Cnmim]Br 有较强的成相能力。目前关于木瓜蛋白酶离子液体双水相萃取的研究主要集中在系统优化这一阶段，液/液相平衡的测定较少，对于其分配模型的研究报道更少。本工作采用浊点法测定[Cnmim]BF4-NaH2PO4体系在298.15 K下的双节线并进行相平衡数据的测定和关联，研究了木瓜蛋白酶的分配系数与该体系下双水相组成浓度的相关度，并建立了木瓜蛋白酶在该体系中的分配模型，为工业化生产提供理论指导和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

木瓜蛋白酶（BR），生工生物（上海）股份有限公司；[C2mim]BF4、[C4mim]BF4、[C6mim]BF4，纯度高于99%，上海成捷化学有限公司；NaH2PO4（分析纯）、NaOH（分析纯），广州化学试剂厂；其他都为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

TU1901 紫外可见分光光度计，北京普析通 用有限责任公司；DK-98-1 型恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；PHS-3C 型pH 计，上海雷磁仪器厂；2WAJ 型阿贝折射仪，上海光学仪器一厂；HJ-5 型多功能恒温搅拌器，常州华奥仪器制造有限 公司。

1.3 方法

1.3.1 相图的测定 在298.15 K 的恒温条件下，利用浊点法测定双节线，制作相图。分别取质量分数为50%的[C2mim]BF4、[C4mim]BF4、[C6mim]BF4溶液放在50 ml 小烧杯中，逐滴向小烧杯中滴加质量分数为40%的NaH2PO4溶液，并不断用磁力搅拌器搅拌，直至出现浑浊点，即为两相区。通过称量计算出离子液体溶液和盐溶液在浑浊点时刻的质量分数。向已浑浊的溶液中逐滴滴加去离子水，直至溶液变澄清为止，即为单相区。称量后，再次向小烧杯中滴加质量分数为40%的NaH2PO4溶液，直至出现下一个浑浊点为止。重复上述操作。

1.3.2 离子液体双水相相平衡的测定 以相图为指导，选取适当的点配制离子液体双水相体系。分别称量不同质量的离子液体溶液和NaH2PO4固体加入5.0 ml 刻度管中，加去离子水补至5.0 ml，在恒温振荡器中振荡20 min，并在25℃的环境中放置3.0 h，使体系达到平衡，溶液完全分相。上、下相离子液体的质量分数可以用折射率[18]确定，NaH2PO4的质量分数可以用酸碱中和滴定法[19]确定。

离子液体质量分数wil、折射率n、NaH2PO4质量分数ws三者的关系如下

方程参数见表1。

表1 [Cnmim]BF4-NaH2PO4 双水相方程式(1)参数Table 1 Parameters of Eq.(1) for [Cnmim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system

1.3.3 离子液体双水相萃取木瓜蛋白酶 以相图为指导，选取适当的点配制双水相体系。分别称量不同质量的离子液体溶液和NaH2PO4固体加入5.0 ml刻度管中，木瓜蛋白酶的添加量为1.0 mg·ml-1（木瓜蛋白酶的质量/体系体积），加去离子水补至5.0 ml，体系pH 7.0，恒温振荡20 min，25℃的环境下静置3.0 h，使体系分相完全。各吸取上、下相液1.0 ml，稀释1.0×104倍，备用。转移1.0 ml 待测液于试管中，加入5.0 ml 考马斯亮蓝染色液，充分振荡使之混匀，以不加酶溶液做空白，在595 nm（离子液体在该波长下没有吸收峰）下测定该液的吸光值A并计算出木瓜蛋白酶的蛋白含量[20]。通过比较实验可知，由于木瓜蛋白酶添加量较少，对折射率影响不大，相对误差在0.2%以内，因此利用1.3.2 的方法测定上、下相中各组分含量。

2 结果与分析

2.1 双节线数据的关联，制作相图

通过Merchuk 方程对双节线实验数据进行关联，制作相图。

式中，a、b、c为方程参数。

Merchuk 方程形式简洁，近年来主要用于离子液体-盐和聚合物-盐双节线数据的关联，效果很好。相关系数（R2）、标准偏差（sda）和方程参数见表2。三角相图如图1所示。

表2 298.15 K时[Cnmim]BF4-NaH2PO4体系双节点关联结果Table 2 Correlation results of solubility for [Cnmim]BF4-NaH2PO4 system at 298.15 K

2.2 利用Othmer-Tobias和Bancroft方程对离子液体双水相液液平衡数据进行关联

Othmer-Tobias 和Bancrof 经验关联方程[21]的表达式如下

图1 298.15 K 温度下[Cnmim]BF4-NaH2PO4 双水相体系 三角相图Fig.1 Triangular phase diagram for [Cnmim]BF4-NaH2PO4system at 298.15 K

式中，K、n、K′、n′为方程参数，见表3；代表上相离子液体质量分数；代表下相NaH2PO4质量分数；wwb代表下相水质量分数；代表上相水质量分数。

由表3可知，Othmer-Tobias 和Bancroft 方程很好地关联了离子液体双水相液液相平衡的数据，线性相关系数（R2）均可达到0.994 以上。作图2、图3。通过回归方程已知下相各组分含量和回归方程参数，可以得到上相各组分含量，[C2mim]BF4、[C4mim]BF4、[C6mim]BF4的平均相对误差分别为-4.51×10-7%、1.01×10-6%、-2×10-6%，NaH2PO4的平均相对误差分别为0.014%、-0.072%、0.019%。方程的拟合结果很好，见表4。

表3 [Cnmim]BF4-NaH2PO4 双水相方程式(3)和 式(4)中的参数Table 3 Parameters of Eqs.(3) and (4) for [Cnmim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system

图2 Othmer-Tobias 方程的线性相关性Fig.2 Linear dependency of Othmer-Tobias equation

图3 Bancroft 方程的相关性Fig.3 Linear dependency of Bancroft equation

2.3 模型

离子液体双水相中木瓜蛋白酶分配系数K定义为双水相体系中上相的木瓜蛋白酶蛋白浓度（Ct）与下相的木瓜蛋白酶蛋白浓度（Cb）的比值，公式如下

表4 298.15 K 时[Cnmim]BF4-NaH2PO4 双水相液液相平衡拟合结果Table 4 Result of liquid-liquid equilibria for [Cnmim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system at 298.15 K/% (mass)

表5 分配系数与双水相体系组分浓度的相关性Table 5 Correlation between partition coefficient and difference in concentration of aqueous two-phase system

表6 模型参数和分配系数预测值与实验值的相对偏差Table 6 Parameters for models calculated average relative deviations between predicted and experimental partition coefficient

变量x和y之间的相关性定义为η

式中，和是变量的平均数。分配系数和参数的相关性见表5。从表5可以得到：上相离子液体浓度与lnK的相关性均高于盐和水，接近1；下相盐浓度与lnK具有较好的相关性。故将上相离子液体浓度和下相盐浓度与该体系的lnK值进行关联，得到的公式如下

式中，A、B、C为方程参数，方程与谢红国模型[22]相似，各参数见表6。

用上述模型拟合了木瓜蛋白酶在[Cnmim]BF4- NaH2PO4体系中的蛋白浓度分配系数和各组分的浓度。由表6可知相对偏差均小于5%，本工作模型与谢红国模型相比相对偏差较小。图4～图6关联了木瓜蛋白酶在[Cnmim]BF4-NaH2PO4体系中的蛋白浓度分配系数和各组分浓度，结果令人满意。相对偏差和关联程度表明本工作模型的建立较其他模型有了较大的改善。

3 结 论

在298.15 K 的恒温条件下：

图4 [C2mim]BF4-NaH2PO4 双水相中木瓜蛋白酶分配系数预测值Fig.4 Prediction of papain partition coefficient for [C2mim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system

图5 [C4mim]BF4-NaH2PO4 双水相中木瓜蛋白酶分配 系数预测值Fig.5 Prediction of papain partition coefficient for [C4mim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system

图6 [C6mim]BF4-NaH2PO4 双水相中木瓜蛋白酶分配 系数预测值Fig.6 Prediction of papain partition coefficient for [C6mim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system

（1）利用浊点法测定双节线，制作相图，并用非线性Merchuk 参数方程关联双节线数据，拟合度均在0.975 以上，结果令人满意；

（2）测定了 [Cnmim]BF4-NaH2PO4双水相体系的液液相平衡数据，并用Othmer-Tobias 和Bancroft方程关联了该数据，线性相关系数在0.994 以上，平均相对误差在0.1%以下，结果理想；

（3）测定了木瓜蛋白酶在[Cnmim]BF4-NaH2PO4双水相体系中的蛋白浓度分配系数，通过Matlab 建立了实验模型并进行了关联，相对偏差在5%以内，与其他模型相比关联很理想。

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