石蒜碱诱导人白血病K562细胞凋亡的研究

王 杨，于 淼，2，3

(1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨150076;2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨150076;3.哈尔滨商业大学药物研究所博士后科研流动站，哈尔滨150076)

中药石蒜为石蒜科植物石蒜的鳞茎，是主要 存在于石蒜科植物鳞茎内的生物碱.随着研究的不断深入，石蒜碱及其衍生物的药理活性及作用机制的研究有了很大进展[1].石蒜碱及其衍生物的药理作用主要有[2－3]:催吐、祛痰、镇静、镇痛、解热的作用[4];抗疟疾、抗炎、抗病毒[5]、抗菌作用[6]、抗癌、抗肿瘤等作用[7－9].白血病是造血组织发生恶性病变，其特点是其他造血组织或骨髓中大量的白血病细胞无限增殖，并进入外周血液，抑制正常血细胞的生成，侵犯人体脏器，最终通过这种浸润的方式，破坏全身组织、器官，造血功能受抑制[10].人白血病细胞K562是从白血病急变期患者的胸水中分离出来的，处于高度未分化状态，是慢性粒细胞白血病(CML)细胞系中的一种[11].CLM是一种在早期多能干细胞上发生的恶性骨髓异常增殖性疾病，当CLM进入急变期往往对化疗药物不敏感[12－13].本文以人白血病 K562 细胞为靶细胞，探讨石蒜碱诱导K562细胞凋亡的机制研究.

P53基因是人体内的抑癌基因，这个基因主要分布于细胞核浆中，能与DNA特异结合，该基因的突变会发生在50%以上的恶性肿瘤形成过程中.这个抑癌基因的失活是肿瘤形成的一个重要原因，由于P53基因可以诱导癌细胞凋亡，还有帮助修复细胞基因的缺陷的功能，进而阻止了肿瘤的形成.P53基因编码的蛋白质作为一种转录因子控制着细胞周期的启动，该基因决定细胞分裂是否开始.如果细胞受损，并且不能得到及时的修复，P53蛋白就会启动相应程序，诱导细胞凋亡的产生，使细胞“自杀”.而发生变化的细胞究竟是被修复还是被诱导凋亡是根据P53对DNA变异程度的判断而决定的，如果DNA变异程度较小，P53基因就会促使细胞自我修复;如果DNA变异程度较大，这个基因就会诱导细胞发生凋亡.

1 材料与方法

1.1 细胞株

人慢性粒细胞性白血病K562细胞株来源于哈尔滨工业大学生命科学与技术学院.

1.2 主要试剂及药物

石蒜碱(纯度98%)(上海阿拉丁试剂有限公司);羟基喜树碱(哈尔滨三联药业有限公司);RPMI 1640培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司);青霉素、链霉素(Gibco公司);CCK－8检测试剂盒(日本同仁公司);P53抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司);鼠抗Actin抗体、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(碧云天生物科技研究所).

1.3 主要仪器

CO－170型CO2培养箱(美国New Brunswick Scientific公司);DL－CJ－1ND型超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司);Model680酶标仪(美国BIO RAD公司);Olympus CKX41倒置显微镜(日本Olympus公司);Adventurer万分之一电子天平(美国OHAUS公司);P型移液器(法国Gilson公司);垂直电泳仪(北京六一仪器厂);GIS－2019型凝胶成像系统(Tannon公司);Anke TDL80－2C离心机(上海安亭科学仪器厂);Allegra 64R冷冻离心机(美国BECK－MAN－COULTER公司);TS－1000型震荡仪(江苏其林贝尔仪器制造有限公司).

2 实验方法

2.1 细胞培养及传代

K562细胞接种于10%胎牛血清的RPMI－1640培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度下培养.K562细胞按4×105/mL接种，置于CO2培养箱培养48～72 h，传代1次，用对数生长期的细胞进行实验.

2.2 CCK－8法测定细胞增殖活性

将处于对数生长期的K562细胞，按4×105/mL接种于96孔培养板，每孔100 μL.实验设置空白孔Ab(不含细胞和石蒜碱的培基);对照孔Ac(含细胞，不含石蒜碱的培基);实验孔As(含细胞的培基，给予不同浓度石蒜碱).12 h后加入配制好的石蒜碱溶液、羟基喜树碱溶液.石蒜碱实验组终浓度分别为 0.5、1、2、4、8、16 μmol/L，对照组加等量的RPMI－1640培养液，每组设5个重复孔.羟基喜树碱实验组终浓度分别为 0.5、1、2、4、8、16 μmol/L，对照组加等量的RPMI－1640培养液，每组设5个重复孔.置于37℃、5%CO2培养箱培养48 h后，每孔加入5 mg/mL 的CCK －8 10 μL，继续孵育2～4 h，置酶标仪上用450 nm和570 nm双波长测各孔吸光度值(OD值).活细胞数目与检测的OD值大小呈正相关.实验重复操作3次.描绘生长曲线，计算IC50值.

细胞存活率计算公式如下:

(细胞抑制率为50%，即为半数抑制率，可用半数抑制浓度(IC50)表示.)

2.3 倒置显微镜进行细胞形态学观察

实验设置对照组(不含石蒜碱);实验组(给予不同浓度石蒜碱);阳性药组(给予羟基喜树碱).将处于对数生长期的K562细胞，按4×105/mL接种于6孔培养板，每孔1 mL.12 h后加入配制好的石蒜碱溶液、羟基喜树碱溶液，实验组石蒜碱终浓度分别为2、4、8 μmol/L;羟基喜树碱组终浓度为6 μmol/L;对照组加等量的RPMI－1640培养液.37℃、5%CO2培养箱孵育48 h后，显微镜下观察细胞生长情况，并采集图像.

2.4 PI单染法检测细胞凋亡

将处于对数生长期的K562细胞，按4×105/mL接种于6孔培养板，每孔1mL.12 h后加入配制好的石蒜碱溶液、羟基喜树碱溶液，实验组石蒜碱终浓度分别为2、4、8 μmol/L;羟基喜树碱组终浓度为6 μmol/L;对照组加等量的RPMI－1640培养液.37℃、5%CO2培养箱培养48 h后，将K562细胞收集到离心管中，1 200 rpm，5 min，弃上清.用冷PBS洗两遍，离心弃上清.将此时的细胞重悬于70%冰乙醇溶液中，4℃固定过夜.将固定好的细胞1 200 r/min，5 min离心，弃上清.冷PBS洗1遍，离心，将上清液慢慢从离心管中吸出，留约50 μL液体，轻轻重悬，将细胞加入到配好的PI染液(含PI 50 mg/mL、RNase 1 g/L、0.1%Triton －100)中.室温下避光染色30 min后，300目尼龙网筛过滤后流式细胞仪检测，激发波长设置为400 nm，发射波长525 nm，检测细胞数为104个.

2.5 Western－blot法检测P53蛋白表达情况

将处于对数生长期的K562细胞，按4×105/mL接种于培养瓶中.12 h后加入配制好的石蒜碱溶液、羟基喜树碱溶液，实验组石蒜碱终浓度分别为2、4、8 μmol/L;羟基喜树碱组终浓度为6 μmol/L;对照组加等量的RPMI－1640培养液.37℃、5%CO2培养箱培养48 h后，4℃、12 000 r/min离心15 min，提取按以上处理孵育48 h的K562细胞的总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量.100℃变性10 min，每个梳子孔中分别加入30 μg含5×蛋白，在12%SDS－PAGE凝胶中进行电泳，80 V直至条带到底端，转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，4℃，一抗孵育过夜，洗膜后，二抗室温振荡器振荡孵育2 h，DAB显色液暗室显色，观察条带，凝胶成像系统拍照并进行分析.

2.6 统计学方法

使用SPSS17.0软件进行统计分析.所得数据均被表示为平均值±标准偏差，两样本均数比较采用t检验.P＜0.05为具有统计学意义.

3 结果与分析

3.1 石蒜碱对K562细胞系增殖的抑制作用

不同浓度的石蒜碱作用于K562细胞后，对细胞的生长具有抑制作用.将六个不同浓度石蒜碱接种细胞48 h时，随着石蒜碱浓度的增加细胞存活率逐渐降低，将酶标仪测出的吸光度值代入公式计算得出石蒜碱IC50=4.13 μmol/L.根据公式计算石蒜碱对人白血病K562细胞的抑制率，绘制抑制曲线，见图1.

图1 石蒜碱对K562细胞的抑制曲线

3.2 倒置显微镜观察K562细胞形态学变化

以下为不同浓度石蒜碱作用K562细胞48 h后，显微镜下细胞形态变化图(见图2).未经药物处理的48 h空白对照组的K562细胞呈圆球形，形态饱满，大小均一，细胞生长旺盛;经药物作用后，细胞外形不规则，细胞皱缩，大小不一，细胞破碎程度随给药剂量增加而增大，细胞数量逐渐较少，有凋亡小体生成，呈浓度正相关关系.高剂量组有坏死倾向.

图2 不同浓度石蒜碱作用K562细胞72 h后显微镜下细胞形态观察图

3.3 PI单染法经流式细胞仪检测细胞凋亡

由图3显示结果可知:石蒜碱作用于人K562细胞后，细胞出现凋亡的亚二倍体峰，该峰的出现抑制了DNA的合成.经计算得出凋亡率分别为:(4.8 ± 0.60)%、(27.2 ± 1.31)%、(19.0 ± 1.93)%、(16.6 ±1.89)%、(13.8 ±1.52)%，有显著性差异(P＜0.05).由此可见，随着给药剂量的减少，细胞凋亡率降低.(见表1)

图3 流式细胞仪检测石蒜碱作用K562细胞凋亡率

表1 流式细胞仪检测石蒜碱对K562细胞的凋亡率

3.4 Western－blot法检测石蒜碱对P53蛋白表达水平变化

用终浓度分别是8、4、2 μmol/L的石蒜碱作用于白血病K562细胞48 h后，Western－blot法检测结果显示，P53蛋白的灰度值随给药剂量的增加逐渐加深.表名石蒜碱能够上调P53蛋白的表达，P53蛋白表达与空白对照组相比具有统计学意义(P ＜0.05).实验结果如图4、表2所示.

图4 石蒜碱对P53蛋白表达的影响

表2 石蒜碱对白血病K562细胞P53蛋白表达的影响

4 讨论

本实验采用石蒜碱作用于人白血病K562细胞后，CCK－8试剂盒检测结果表明石蒜碱对K562细胞具有生长抑制作用，且作用相对明显.抑制率具有剂量依赖性，随着药物剂量的加大，抑制率逐渐升高.光学显微镜下观察结果显示相对于未给药的K562细胞，给与不同剂量的石蒜碱，随着给药剂量的增加，细胞数量逐渐减少，细胞体积大小不一，碎片化程度逐渐升高，高剂量组出现凋亡小体.碘化丙啶染色细胞，经流式细胞仪分析发现，DNA直方图上G0/G1峰前出现一个凋亡峰，根据这个凋亡峰可以计算凋亡细胞占整个样品的百分率，结果显示细胞凋亡百分率升高，说明石蒜碱对K562细胞的抑制作用与凋亡有关.

Western－blot法检测P53蛋白表达情况研究中，由于P53基因是人体内的抑癌基因，这个抑癌基因的启动说明细胞正处于自我修复或诱导癌细胞凋亡状态，所以本实验中石蒜碱的作用引起P53基因表达升高，也可以说明石蒜碱诱导K562细胞发生凋亡时，P53蛋白起到了抑制癌细胞继续生成的作用.综上所述，石蒜碱可能是通过上调抑癌基因P53基因的表达，诱导白血病K562细胞产生凋亡诱导作用.但其在诱导白血病细胞凋亡的途径上，具体经过哪一条凋亡诱导途径，还有待进一步研究，这也为石蒜碱在将来的临床抗肿瘤新药的研发提供了实验基础.

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