人参皂苷Rb1、维生素B12抑制亚砷酸钠诱导人脐静脉内皮细胞凋亡及其机制的研究

史艳芬，牛 云，罗 杰，笪冀平

（中日友好医院 病理科，北京 100029）

地砷病在全球发展较快，严重威胁人类健康，预防是这类疾病最关键的一个环节，目前还未找到能有效防止血管损伤的药物。本作者前期研究结果表明NaAsO2诱导HUVECs细胞凋亡，HUVECs细胞凋亡是导致血管损伤的基础，氧化应激可能是其发生的重要原因[1]。

人参皂苷 Rb1（Ginsenoside，Rb1）作为人参的主要成分之一，其内含有能够清除自由基的抗氧化物质，发挥很多重要作用，其中包括：对很多种肿瘤细胞有一定的抑制作用；在抗衰老方面的功效，研究发现人参皂苷可以抗神经细胞凋亡还可以促进血管再生[2]。所以人参皂苷Rb1对地砷病的预防和治疗存在潜在价值。据报道人参皂苷Rg1对血管紧张素Ⅱ诱导的内皮细胞凋亡具有一定的保护作用[3]；在研究人参皂苷抑制脑细胞凋亡作用时发现主要是通过减少NO产生，增加SOD活性[4]。此外，人参皂苷抗神经细胞凋亡作用机制可能与线粒体内的膜电位降低有关[5]。本研究在前期工作中已经证实，NaAsO2诱导血管内皮细胞凋亡在地砷病血管损伤中的重要作用，而人参皂苷Rb1保护血管损伤的研究未见相关报道。

维生素B12（Vitamin B12）是一种含钴的微量元素，在人和动物体内必不可少。当人体缺乏该维生素时可导致血液异常，认知紊乱，及神经病等，严重者可导致死亡。VB12来源于动物性食物，它的缺乏与饮食，吸收和代谢改变有关。有报道，维生素B12和叶酸共同作用于冠心病防治研究[6～8]。关于维生素B12对砷诱导内皮细胞凋亡方面的研究未见报道。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂

HUVEC（人脐静脉内皮细胞）系来源于ATCC细胞库。Rhodamine123和活性氧检测试剂盒购于碧云天，IMEM培养基购自Gibco公司；新生牛血清购自杭州四季青公司，人参皂苷Rb1由吉林大学白求恩医学院化学系赠送，维生素B12（Vitamin B12）购于鼎国公司。

1.2 细胞培养

取出保存在液氮中的HUVECs细胞，立即在水浴锅中快速摇动至冻存液融化50%以上时，转入超净工作台操作。用移液器将冻存管内含细胞的冻存液移入离心管，加入IMEM 5ml混匀，1000 rpm，离心5min，弃上清。加含10%胎牛血清IMEM培养液悬浮细胞沉淀，轻吹混匀，移入培养瓶内，加5ml含10%胎牛血清培养液放置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。

1.3 亚砷酸钠溶液的制备

亚砷酸钠（NaAsO2）是一种白色粉末，易溶于水，分子量为129.91。用电子天平称量NaAsO2粉末0.6495g，溶于装有10ml IMDM（含10%胎牛血清）的小青瓶中，振荡混匀，使NaAsO2充分溶解，得到NaAsO2溶液浓度为0.5mol/L，用不加血清的IMDM培养基稀释成NaAsO2浓度为20μM的工作液。

1.4 实验分组

常规培养的HUVECs细胞经酶消化后以5.0×105/ml的细胞密度接种于6cm的培养皿中，于37℃、5%CO2条件下生长，当细胞长至指数增长期时，加入已经用IMEM培养基配制好的不同浓度药物溶液并进行分组：

①NaAsO2诱导组：加入上述NaAsO2储存液使其终浓度为20μM。

②人参皂苷Rb1组（储存浓度为4mg/ml）：用20μM NaAsO2溶液分别配制成 1.25μg/ml组、2.5μg/ml组、5μg/ml组。 Vitamin B12组（储存浓度为50mg/ml）：用20μM NaAsO2溶液分别配制成5μg/ml组、10μg/ml组、20μg/ml组、40μg/ml组。人参皂苷Rb1与Vitamin B12共同作用组：1.25μg/ml人参皂苷 Rb1+10μg/ml Vitamin B12组 （混合 1）；2.5μg/ml人参皂苷 Rb1+20μg/ml Vitamin B12组（混合 2）；5μg/ml人参皂苷 Rb1+40μg/ml Vitamin B12组（混合 3）。

③对照组：加入等体积IMEM培养基。以上细胞经诱导培养24h，接着用这些制备好的细胞检测凋亡和活性氧 （reactive oxidative species，ROS）水平。

1.5 Annexin V-FITC法检测细胞凋亡

收集各组细胞分别放于1.5ml的EP管中，1500rpm离心5min；去掉上清液，用0.1M的冷PBS缓冲液（4℃预冷）冲洗 3次；加入 500μl的Binding Buffer悬浮细胞；加入5μl Annexin VFITC，混匀；4℃、避光、孵育 15min；再加入 10μl PI， 混匀；4℃、避光、孵育 5min；用流式细胞仪检测。

1.6 DCFH-DA活性氧检测

收集各组细胞分别放于1.5ml的EP管中，1500rpm离心5min；去掉上清液，用0.1M的PBS缓冲液冲洗3次，在每个EP管中各加入500μl用无血清培养基稀释得到浓度为10μM的DCFH-DA，充分混匀；避光、37℃细胞培养箱、孵育20 min；每隔3～5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触；孵育完毕后，再用无血清培养基洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFHDA；把准备好的细胞通过流式细胞仪检测。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0版软件包进行统计学处理，组间均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 人参皂苷Rb1保护NaAsO2诱导的HUVECs凋亡

图1人参皂苷Rb1对HUVECs损伤的保护作用

图2 维生素B12对HUVECs损伤的保护作用

作者在前期研究中已证实，NaAsO2诱导HUVECs凋亡，为了研究人参皂苷Rb1是否保护HUVECs凋亡，本实验在NaAsO2的基础上加入不同浓度人参皂苷Rb1，结果如图1所示：人参皂苷组细胞凋亡率明显低于NaAsO2作用组 （P＜0.05），且凋亡细胞率随着人参皂苷浓度的增加而降低，表明人参皂苷Rb1可以降低NaAsO2诱导的HUVECs凋亡，从而发挥保护作用。

2.2 维生素B12保护NaAsO2诱导的HUVECs凋亡

为了研究维生素B12是否会保护HUVECs，本实验在NaAsO2的基础上加入不同浓度维生素B12，结果如图 2所示：10μg/ml以下浓度组与NaAsO2作用组相比无统计学意义 （P＞0.05），10μg/ml浓度以上的维生素 B12组（包含 10μg/ml）细胞凋亡率低于NaAsO2作用组，并有统计学意义，且凋亡细胞率随着维生素B12浓度的增加而降低，表明维生素B12≥10μg/ml可以降低NaAsO2诱导的HUVECs凋亡，从而发挥保护作用。

2.3 人参皂苷Rb1和维生素B12联合作用保护NaAsO2诱导 HUVECs凋亡

人参皂苷Rb1能保护NaAsO2诱导HUVECs损伤，维生素B12同样能保护NaAsO2诱导HUVECs损伤，如果两者共用是否会有协同作用，本实验在NaAsO2的基础上加入不同浓度二者混合物，结果如图3所示：二者混合物组细胞凋亡率显著低于NaAsO2作用组（P＜0.01），且凋亡细胞率随着混合物浓度的增加而降低，表明二者混合物可以明显降低NaAsO2诱导的HUVECs凋亡，且二者具有一定的相加作用。

图3 二者混合物对HUVECs损伤的保护作用

图4 人参皂苷Rb1对NaAsO2改变HUVECs ROS生成的影响

图5 维生素B12对NaAsO2诱导HUVECs ROS生成的影响

图6人参皂苷Rb1和维生素B12共用对NaAsO2诱导HUVECs ROS生成的影响

2.4 人参皂苷Rb1对NaAsO2诱导 HUVECs内ROS生成的影响

人参皂苷组孵育细胞后，用流式细胞仪检测HUVECs细胞内ROS含量。如图4可见：在NaAsO2溶液中加入不同浓度的人参皂苷后，与NaAsO2组相比均能显著降低细胞内ROS含量，有统计学意义（P＜0.01），具有剂量效应关系。这一结果提示人参皂苷Rb1具有抗氧化应激活性。

2.5 维生素B12对NaAsO2诱导 HUVECs内ROS生成的影响

维生素B12组孵育24h后，用流式细胞仪检测HUVECs内ROS含量。如图5可见：10μg/ml以下浓度组与NaAsO2作用组相比无统计学意义（P＞0.05），10μg/ml浓度以上的维生素 B12组 （包含 10μg/ml）与 NaAsO2组相比，均能降低细胞内ROS的含量，有统计学意义（P＜0.05），而且具有剂量效应关系。这一结果说明维生素B12能降低ROS的产生，提示具有抗氧化应激活性。

2.6 人参皂苷Rb1和维生素B12联合作用对NaAsO2诱导HUVECs产生ROS水平的影响

人参皂苷Rb1降低NaAsO2诱导HUVECs内ROS的水平，维生素B12同样降低HUVECs损伤后细胞内ROS的水平，为探讨二者联合对细胞内ROS的影响，本实验在NaAsO2的基础上加入不同浓度的二者混合物（具体见分组），结果如图6所示：二者混合物组细胞内ROS含量显著低于NaAsO2作用组（P＜0.01），且 ROS 随着混合物浓度的增加而显著降低，具有剂量效应关系。表明二者混合物可以显著降低NaAsO2诱导的HUVECs细胞内ROS的产生，通过统计分析发现二者不具有相加作用（P＞0.05）。

3 讨论

地砷病患者长期处于高砷环境中，根据大量流行病学调查结果，这类患者早期主要表现为周围血管疾病、皮肤损伤、动脉粥样硬化、高血压等以血管内皮细胞损伤和凋亡为基础的一类疾病。其原因可能是高浓度砷触发了内皮细胞的氧化应激通路和信号转导途径，更早地启动了内皮细胞的凋亡程序，导致血管内皮功能发生紊乱和损伤，从而阻碍细胞的正常增殖。

线粒体产生活性氧自由基 （ROS），ROS再作用线粒体，造成线粒体膜脂质过氧化反应，破坏线粒体膜结构及功能损伤，从而导致细胞凋亡。在前期研究中我们已经证明NaAsO2诱导HUVECs细胞凋亡主要通过线粒体途径[1]。

本实验采用体外培养HUVECs细胞，建立由高砷诱导的血管内皮细胞损伤模型，同时分别加入不同浓度的人参皂苷Rb1及维生素B12进行干预。研究结果显示，20μM亚砷酸钠导致内皮细胞凋亡率远大于正常对照组，且同时内皮细胞释放的ROS含量明显增加，提示高浓度砷激活氧化产物，从而明显加剧血管内皮细胞氧化损伤。而在高浓度砷作用组中分别加入不同浓度人参皂苷Rb1、维生素B12及二者混合液，能显著降低受损细胞的ROS含量，并减少高浓度砷导致的血管内皮细胞凋亡。证实了人参皂苷Rb1及维生素B12分别对HUVECs细胞有一定保护作用，且二者混合作用更佳。

人参皂苷Rb1作为中药人参中主要成分之一，具有提高机体免疫力、抗衰老、抗癌、抗辐射、抗缺氧多方面的功效成为近年来研究的热点。在抗癌方面，相关研究在肺癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌等发现其作用机制主要表现在：人参皂苷诱导肿瘤细胞凋亡[9～11]；使肿瘤细胞周期停滞[12]。而在非肿瘤方面的研究显示，人参皂苷Rb1的作用主要参与了体内的氧化应激通路，如人参皂苷可抑制多巴胺诱导PC12细胞内NO的生成，从而降低该细胞内 ROS含量来保护 PC12细胞的[13，14]；人参皂苷Rb1可以有效提高黑素瘤细胞抗氧化应激的作用[15]。在波动性高糖导致HUVEC细胞凋亡过程中，人参总皂苷通过增强SOD活性保护HUVEC细胞的损伤[16]。本实验选取人参总皂苷Rb1为干预药物，结果亦证实了其有效清除细胞内过多的自由基，阻止自由基和脂质过氧化物过度产生的功效。提示其可能通过促使某些细胞凋亡抑制基因高表达而达到抑制细胞凋亡的作用，从而能在高浓度砷中增强血管内皮细胞抗氧化和抗凋亡的能力，对细胞膜和线粒体膜起到保护作用。

维生素B12的研究主要集中在冠心病方面，最近有文献报道在大鼠实验中，维生素B12和叶酸能保护砷诱导的肝细胞损伤[17]，Majumdar等[18]也证实维生素B12和叶酸合用能保护砷诱导的线粒体和DNA损伤。本实验结果同样证实，维生素B12在高浓度砷环境中有效保护NaAsO2诱导的HUVECs凋亡，此结果主要是通过抑制细胞内ROS水平实现；人参皂苷Rb1和维生素B12联合使用后显著降低了HUVEVs细胞的凋亡，有效保护了亚砷酸钠对内皮细胞的损伤。由于大量产生的自由基所引起的氧化损伤和内皮细胞凋亡，是引起地砷病早期血管病变的重要因素，因此，清除体内自由基是预防地砷病血管并发症的关键。本实验为探索人参皂苷Rbl及维生素B12在延缓地砷病血管疾病方面的良好应用前景提供了理论基础。但由于目前对高浓度砷产生氧化应激的通路及细胞凋亡机制尚不明确，因此有待更深入的研究予以证实。

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