紫外可见光谱法研究EGCG的稳定性

李邦玉 吴媛 吴虹燕 刘臣

摘要：考察绿茶中表没食子儿茶素没食子酸酯在多种体系中的稳定性。通过柱色谱分离纯化绿茶中的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）产品；采用紫外可见分光光度法定性研究温度、时间、酸碱、紫外光、溶剂等对EGCG稳定性影响，以及EGCG分别与H2O2、DPPH·的反应。研究结果，温度、时间、酸碱、紫外光等都不同程度影响EGCG稳定性，紫外可见光谱跟踪到了H2O2、DPPH·与EGCG的反应。

关键词：表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）；稳定性；紫外可见分光光度法

中图分类号：TS201.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0294-03

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是绿茶所含儿茶素中含量最多的功能成分。因为含有多个酚羟基，EGCG具有很强的抗氧化活性，医药工业上应用于抗菌、抗癌、抗衰老等治疗，能够改善癌细胞对化疗的敏感性并减轻对心脏的毒性[1-3]。在食品工业中EGCG应用于抗氧化、保鲜、祛臭等产品，日化工业中作特殊功能添加剂等[4]。但是在含茶叶的食品、药品和饮料的加工和储藏过程中，EGCG易受到温度、金属离子、酶和pH值等因素的影响，极易发生化学变化，从而改变了其原先的结构和生物活性[5-7]。因此考察EGCG的稳定性很有必要。本试验采用紫外可见分光光度法，定性研究不同环境条件下EGCG的稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

EGCG对照品（南京广润生物制品，98%），DPPH·（Sigma 公司生产）、无水乙醇、30%过氧化氢、盐酸、氢氧化钠、己烷、乙酸乙酯、四氯化碳、三氯甲烷、甲醇，以上药品皆为国产分析纯试剂。绿茶为苏州东山碧螺春茶厂提供。

紫外可见分光光度计：型号UV-1801；十万分之一天平：CPA 225D；电热恒温水浴锅；三用紫外分析仪：WFH-203，上海精科实业有限公司；P230 型高效液相色谱仪：配有P230+紫外检测器；P230/P230p高压恒泵；EC2000 色谱工作站：大连依利特分析仪器有限公司生产；RUC-5200型超声波清洗机：上海睿祺公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 EGCG的分离提纯 取绿茶10 g，置于250 mL容量瓶中，加入95%乙醇150 mL，80 ℃超声提取30 min，提取2次，合并提取液，过滤、80 ℃减压回收乙醇，所得浓缩液上聚酰胺树脂，以乙醇-醋酸梯度洗脱，薄层层析跟踪检测，收集EGCG部位流分，脱色、浓缩、重结晶，得EGCG纯品，液相色谱法检测产品成分与纯度。

1.2.2 浓度对EGCG的影响 依次量取浓度为501.4 μg/mL EGCG储备液 0.10、0.20、0.32、0.49、0.64 mL于25 mL的比色管中，添加无水乙醇至10 mL，配制浓度分别为8、12、16、24、32 μg/mL的梯度溶液，用紫外-可见分光光度计进行光谱扫描。

1.2.3 温度对EGCG溶液的影响 分别吸取浓度为 501.4 μg/mL EGCG储备液2 mL于4支25 mL比色管中，添加无水乙醇至10 mL，制成同浓度的溶液，分别放入室温、40、60、80 ℃温度的水浴锅中30 min，用紫外-可见分光光度计进行光谱扫描。

1.2.4 时间对EGCG溶液的影响 分别吸取EGCG储备液2 mL于5支比色管中，添加无水乙醇至10 mL，制成同浓度的溶液，将其中4支比色管放入80 ℃水浴锅中，分别在1、3、5、7 h后扫描吸收曲线，剩下1支不加热作为原液进行对比。

1.2.5 紫外灯照射对EGCG溶液的影响 分别吸取2 mL EGCG储备液于6支25 mL比色管中，添加无水乙醇至 10 mL，制成同浓度的溶液，将其中的5支比色管置于照射频率为254 nm紫外灯下照射，照射时间分别为20、40、60、320、400 min，留1支比色管不照射紫外光作为对照，用紫外-可见分光光度计进行光谱扫描。

1.2.6 pH值对EGCG溶液的影响 分别吸取0.5 mL EGCG储备液于3支25 mL比色管中，再加入4 mL水，编号1、2、3，1号作为对照液进行定性扫描，向2号比色管中逐滴加入010、0.25、0.40、0.55、0.70、0.85 mL盐酸（0.01 mol/L），分别定性扫描后与原液对比；向3号比色管中逐滴加入0.1、02、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL氢氧化钠（0.01 mol/L），分别定性扫描后与原液对比。

1.2.7 溶剂对EGCG溶液的影响 分别称取EGCG 0.25 mg，转入25 mL比色管中，分别加入水、己烷、乙酸乙酯、四氯化碳、三氯甲烷、甲醇、乙醇定容至25 mL，配制成浓度为10.0 μg/mL EGCG溶液，用紫外-可见分光光度計进行光谱扫描。

1.2.8 H2O2与EGCG溶液的反应 量取4 mL 0.1 mmol/L EGCG储备液至25 mL比色管中，不断滴加0.04 mol/L的过氧化氢溶液，连续扫描其紫外吸收光谱图。

1.2.9 EGCG与DPPH·的反应 量取4 mL 0.1 mmol/L EGCG储备液至25 mL比色管中，不断滴加0.1 mmol/L的 DPPH· 乙醇溶液，连续扫描其紫外吸收光谱图。

2 结果与分析

2.1 液相色谱法检测EGCG产品成分及含量

摸索得到的色谱分离条件为：色谱柱：Shimpak C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水-冰醋酸（20 ∶80 ∶0.2）；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量5 μL。纯化的样品及EGCG对照品色谱如图 1、图2。EGCG 纯度大于97%。

2.2 浓度对EGCG溶液的影响

由图3可知，EGCG在210、276 nm处都有吸收峰。从a到e，随着EGCG溶液浓度升高，EGCG在276 nm处吸收峰位置不变且随着EGCG浓度增大而逐渐升高，可以作为其特征吸收，只是浓度过低时不显著。而在200～220 nm处吸收峰不稳定，随浓度增大而发生红移，所以该处吸收不能作为其特征吸收。

2.3 温度对EGCG溶液的影响

对4组100.2 μg/mL EGCG溶液，分別考察其在室温、40、60、80 ℃的水浴锅中加热30 min后的变化，用紫外-可见分光光度计进行定性光谱扫描。从图4可以看出，随着温度的升高，EGCG溶液吸收曲线基本形状没有变化，只是吸收强度随温度的升高逐渐减弱，说明该浓度的EGCG溶液加热时发生了部分降解，温度越高降解程度越大。王静等发现即使在0 ℃氧化2 min，EGCG的氧化程度也会达0.3[7]。

2.4 加热时间对EGCG溶液的影响

从图5可以看出，80 ℃下放置一段时间后，EGCG溶液吸收曲线大体形状没有改变，276 nm处特征吸收峰位置没有变化，吸光度值随放置时间延长而增大，1～5 h内，吸收峰升高且趋于稳定，而7 h后吸收强度再次大幅增加。276 nm处吸收强度增大应该与EGCG浓度增大没有关系，可能是其他类似物质大量产生引起的。吴平等研究了不同温度热处理的EGCG，发现EGCG的氧化产物比较复杂，无法进行定量分析[8]，有待进一步研究。

2.5 紫外灯照射对EGCG溶液的影响

从图6可知，EGCG经一段时间紫外光照射后，其吸收曲线基本形状没有明显改变，随着照射时间延长，276 nm处特征吸收强度逐渐降低，可能是EGCG在紫外光照射下逐渐发生某种降解的缘故。

2.6 酸碱对EGCG溶液的影响

由图7可知，EGCG溶液中加入不同量的盐酸后，溶液颜色没有变化，其光谱图基本形状也没有明显变化，从276 nm特征吸收处观察，随着加入盐酸的量逐渐增多，276 nm处吸收强度降低幅度逐渐增大，但是总体幅度不大，说明EGCG在酸性体系中是相对稳定的，随着酸性增强稳定性逐渐有所降低。陈利燕等将不同酸度（pH值分别为2.6、3.6、4.6、5.6）的儿茶素溶液在25 ℃放置18 h后，儿茶素的含量都有所减少，而EGCG是8种儿茶素组分中最稳定的[6]。

向EGCG溶液中逐滴加入氢氧化钠时，溶液由无色变为浅橙色，且逐渐加深。从图8可以看出，从b到j，EGCG体系中加入碱的量逐渐增大，EGCG光谱图形发生明显变化，在276 nm处的特征吸收峰随着氢氧化钠加入越来越弱，在 323 nm 附近产生了1个新吸收宽峰，并且随着氢氧化钠的进一步加入，新吸收峰323 nm处强度越来越大。张玉艳等发现在碱性环境下，儿茶素酚羟基易与氢氧化钠作用生成酚钠，因此溶液呈现淡红色，生成的苯氧基负离子使吸收波长红移[9]。王静等也认为碱性条件有利于儿茶素B环上·OH的裸露，更易发生氧化聚合，导致碱性条件下EGCG反应速率较快[7]。

2.7 溶剂对EGCG溶液的影响

EGCG在己烷、乙酸乙酯中不溶、在四氯化碳、三氯甲烷中稍溶，能溶于乙醇、甲醇和水中。EGCG的溶解度大小和溶剂的极性大小一致：水>甲醇>乙醇>乙酸乙酯>氯仿>四氯化碳>己烷，说明EGCG的溶解性随溶剂极性的减小而降低。

从图9可以看出，EGCG的特征吸收峰位置不随溶剂变化而改变，且乙醇作为溶剂时，EGCG溶液在276 nm处的吸收峰最强。EGCG在不同溶剂中276 nm处吸收强度顺序为：水<甲醇<乙醇，这与三者的极性大小顺序正好相反。在210 nm附近的吸收，随溶剂乙醇、甲醇、水极性升高而蓝移波数依次增加，且吸收强度逐渐减低。

2.8 H2O2与EGCG溶液的反应

由图10可知，从b到r，在EGCG溶液中，随着H2O2加入量的不断增加，EGCG溶液在276 nm处的吸光度逐渐降低，最后消失，说明EGCG的特征结构已经遭到破坏。

2.9 EGCG与DPPH·的反应

从图11可以看出，在EGCG溶液中滴加少量DPPH·后，EGCG的276 nm吸收峰位置和强度基本没有变化，而 250 nm 以及300～500 nm处吸收峰随着DPPH·的不断加入，吸收强度呈逐渐升高，以至于EGCG的276 nm特征吸收峰相对强度逐渐降低。说明体系中生成了其他物种，使吸收带复杂起来。

3 结论

采用紫外可见分光光度法定性研究了EGCG在不同体系中的稳定性，初步跟踪了EGCG与H2O2、DPPH·的反应。发现EGCG的稳定性较差，温度、紫外光照、持续受热、酸碱条件、氧化剂和自由基等都会引起它的分解或转化。EGCG与H2O2、DPPH·的反应过程中紫外可见吸收光谱连续变化明显。

参考文献：

[1]仉燕崃，李 楠，韩国柱，等. 表没食子儿茶素没食子酸酯的研究进展[J]. 中草药，2006，37（2）：303-306.

[2]朱发伟. 茶叶中表没食子儿茶素没食子酸酯的研究进展[J]. 中草药，2005，36（8）：1271-1272.

[3]葛 建，林 芳，李明揆，等. 表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）生物活性研究进展[J]. 安徽农业大学学报，2011，38（2）：156-163.

[4]臧 鹏，屈维丽，于燕波，等. 表没食子儿茶素没食子酸酯在食品体系中的抗氧化作用研究[J]. 食品工业科技，2011，32（11）：361-363.

[5]陈惠衡，傅冬和，施 玲，等. 儿茶素稳定性试验研究[J]. 食品研究与开发，2009，30（4）：10-12.

[6]陈利燕，屠幼英，陈 暄，等. 儿茶素在酸性环境中的稳定性研究[J]. 茶叶，2002，28（2）：86-88.

[7]王 静，戚向阳. 表没食子酸儿茶素没食子酸酯体外氧化影响因素及其氧化产物分析[J]. 精细化工，2006（11）：1094-1098.

[8]吴 平，夏 涛，高丽萍，等. 热处理过程中表没食子儿茶素没食子酸酯变化的动力学研究[J]. 食品与发酵工业，2010，36（11）：34-39.

[9]张玉艳，沈生荣，唐德松，等. Cu2+与EGCG络合作用的研究[J]. 浙江大学学报：农业与生命科学版，2004，30（3）：290-295.