代谢控制发酵产琥珀酸研究进展

王乐，倪子富，惠明，王金水

（河南工业大学生物工程学院，河南 郑州 450001）

引 言

琥珀酸作为许多重要化学品的直接或间接合成中间体被广泛应用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、新型绿色溶剂、高分子聚合物等化工产品，具有很高的商业价值[1-2]。目前生产琥珀酸的方法主要有化学合成法和生物发酵法两种，化学合成法虽为目前琥珀酸生产的主要方法，但具有能耗高、污染大等缺点，不符合当今可持续发展的要求[3]。近几年随着生物工程技术的迅速发展和逐渐成熟，生物发酵法生产琥珀酸因兼具资源可再生利用及吸收CO2等优势具有广阔的发展潜力[2]。

表1 产琥珀酸菌株的性能分析Table 1 Performance analysis of strains of succinic acid production

当前国内外研究琥珀酸生产的热门菌种有：产琥珀酸厌氧螺菌、产琥珀酸放线杆菌、曼海姆产琥珀酸菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母和重组大肠杆菌等[3]。表1对以上产琥珀酸菌种的性能进行了分析，可知所有菌种在发酵生产中都存在一定的缺陷。但综合各方面分析条件可以看出，大肠杆菌（E.coli）在琥珀酸生产中的优势十分明显，具有遗传背景清楚[5,9]、代谢网络明确[10]、易操作、易改造、易培养等优点，因而大肠杆菌是目前用于研究琥珀酸代谢途径和提高琥珀酸产量的优势基因工程菌种。

国外对利用基因工程菌E.coli发酵生产琥珀酸的研究开始于20世纪90年代，国内在近几年也逐渐成为研究的热点[11]。野生大肠杆菌在厌氧条件下进行混合酸发酵，副产物种类复杂且产量大，如果对E.coli调控代谢路径中的关键酶进行改造，如过量表达产琥珀酸代谢通路上的关键酶、敲除代谢竞争途径中的酶基因、导入外源酶基因等形式使碳流量主要流向琥珀酸[12]，则能大大改善生产琥珀酸的能力。另外，琥珀酸作为还原性的终端产物需要有充足的还原力才能推动代谢底物向C4转化，所以维持NAD(H)平衡和提高NAD(H)的水平对琥珀酸生产十分有利[13]。CO2作为辅助底物和酶激活剂调节着代谢流的分配比，保证CO2的充足供应是一个重要的调控策略[14]。另外通过基因改造来增加其他代谢路径也是提高琥珀酸产量的一种有效方法。总之，随着各方面研究的深入，琥珀酸代谢控制发酵的方式也将更加趋于多样和成熟。

本文将主要介绍代谢控制琥珀酸发酵的若干进展。

1 对代谢路径中的关键酶基因进行调控

由于琥珀酸发酵的代谢网络复杂，涉及众多酶催化反应，对基因逐个改造难度大。所以通过对代谢路径中的关键酶基因进行改造，如增强主代谢路径上的酶基因、引入表达外源相关酶基因、阻断竞争途径中的酶基因表达等，可有效改变代谢通路中的碳流量分布，使琥珀酸的产量和生产强度均有较大提高。

1.1 过量表达代谢途径中的关键酶基因

磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）作为糖酵解的中间产物和琥珀酸的前体物是E.coli代谢的重要节 点[13]。PEP 羧化酶（PPC）和PEP 羧化激酶（PCK）是催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）到草酰乙酸（OAA）的两个关键酶，其活性大小直接影响流向琥珀酸的代谢流流量。Millard 等[1]在大肠杆菌中分别过量表达大肠杆菌的羧化酶基因ppc 和羧化激酶基因pck时发现，PPC 可能是催化PEP 生成OAA 的主要酶，并且具有直接催化PEP 生成琥珀酸的异生作用。但当ppc 被敲除时，PCK 也能达到同样的催化效果。也有人将蓝藻细胞的ppc 基因导入磷酸转移酶PTS突变的大肠杆菌中过量表达，发现由于光合生物中ppc 基因对CO2的吸收活性高，所以显著增强了PEP向OAA 的碳通路，同时磷酸葡萄糖转移酶系统（PTS）缺陷也有利于菌体对混合糖的吸收转化[15]。曹剑磊等[16]利用Xer/dif 重组酶系统构建了琥珀酸竞争代谢途径中包括乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶基因（ackA-pta）、乳酸脱氢酶基因（ldhA）、丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）、乙醇脱氢酶基因（adhE）在内的缺失突变大肠杆菌菌株，阻断了副产物的生成路径，同时又敲除葡萄糖吸收途径中PTS 系统的pstG 基因，改变了大肠杆菌对葡萄糖的吸收方式，在此基础上过量表达ppc 基因，经证实该菌株在厌氧条件下能高效转化葡萄糖，琥珀酸生产强度可以达到1.01 g·L-1·h-1，并且不存在乙酸、甲酸等副产物的生成，是极具工业化生产潜力的优势菌株。

Lee 等[17]在大肠杆菌中过量表达E.coli中的pck 时发现PPC 和PCK 的相对活力与 HCO3-的浓度有关，当 HCO3-浓度低时，羧化反应主要由PPC 催化进行；反之，由PCK 作为PEP 的主要催化酶。原因是PPC 对碳酸氢盐的亲和力和催化速率均高于PCK，但由于PCK 的催化反应伴有能量生成，使菌株不必通过乙酸等其他途径便可以合成ATP，因而在理论上更有利于促进琥珀酸的积累及降低副产物的量，所以在高浓度的碳酸氢盐下，PCK 占主导催化作用[18]。于丽等[5]以大肠杆菌W3110（Δpfl，Δldh）为出发菌株，利用λ-Red 同源重组系统构建了其 ppc 缺陷菌株并在此基础上过量表达了Bacillus subtilispck 基因，重组后大肠杆菌恢复厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，同时产酸量达到原来的15.3 倍。在两阶段发酵的有氧段加入乙酸钠作为诱导剂可提高PCK 和PYK 的酶活进而增加E.coliJM001 的产酸量，但也造成乙酸和丙酮酸过量积累，而通过敲除E.coliJM001 的ppc 基因同时导入外源B.subtilis168 的pck 基因，不但使有氧阶段无须添加乙酸钠便能达到更高的产酸收率，同时副产物较出发菌株大幅减少[19]。

在琥珀酸发酵的整个代谢通路中，并非只是依靠PPC 和PCK 便能完成所有反应，发酵过程中诸如富马酸还原酶（FrdABCD）、富马酸酶等其他关键酶的参与对目标产物的影响也至关重要[20]。通过 在大肠杆菌中过量表达FrdABCD 基因直接催化富马酸合成琥珀酸的实验发现，富马酸的转化率可达到0.93 g·g-1[5]。可见在发酵过程中增加富马酸还原酶的表达量对减少富马酸的积累、增加琥珀酸的产量也十分有利。另外有报道指出琥珀酸发酵过程中富马酸积累到一定浓度时会产生反馈抑制，造成苹果酸的积累，因此在发酵结束后仍会有大量残留的苹果酸被排出或转化为丙酮酸积累起来[21]。苹果酸的积累使碳流量未能充分流向琥珀酸，造成资源的极大浪费，所以富马酸酶也是琥珀酸发酵中的关键酶。为解决这一问题，Hong 等[20]在大肠杆菌中过量表达富马酸酶，积累的苹果酸得以消除，琥珀酸产量获得进一步增长。

1.2 对竞争途径中的酶基因进行精确敲除或失活

厌氧发酵生产琥珀酸的代谢路径复杂，常伴有乳酸、甲酸等副产物的生成，为获得高浓度的琥珀酸积累，需要切断其他无关代谢路径，以保证更多的代谢流向琥珀酸分配。但某些基因在敲除或失活之后会影响相关蛋白质的生成进而造成菌体代谢强度降低，生长缓慢等缺陷[22]。如表2所示，产琥珀酸菌株尤其是重组大肠杆菌在进行不同类别的基因改造之后琥珀酸的产量和生产强度改变程度各异，可见不同基因片段之间的表达差异相差巨大。Chong 等[29]通过将Ant Colony Optimization（ACO）和Minimization of Metabolic Adjustment（MoMA）相结合形成一种新型全面的混合算法，精确分析了大肠杆菌中琥珀酸代谢路径上所需敲除的基因片段，在经过精确敲除后琥珀酸产量得到提高，而生产强度较出发菌株变化不大。而Lee 等[30]将基因比较分析和计算机模拟代谢分析相结合的技术用于预测敲除基因，在比较了M.succinici producens和E.coli之后发现，通过去除有关丙酮酸合成的基因（如pstG、pykF 和pykA 基因）来加强向琥珀酸的代谢流，经实验测得琥珀酸产量达到原来的7 倍多，生产强度为原来的9 倍多。

表2 产琥珀酸菌种的厌氧发酵结果Table 2 Anaerobic fermentation result of succinic acid producing strains

2 调控NAD(H)对琥珀酸代谢的影响

大肠杆菌在厌氧及不接受外源电子受体下混合发酵产琥珀酸的量仅占7.8%，其他大部分为乙醇、甲酸、乙酸和乳酸。这些副产物的生成降低了琥珀酸的产率，同时为后续的分离工作增加许多困难[31]。由图1大肠杆菌的厌氧混合酸发酵代谢网络可知，通过对大肠杆菌中乳酸脱氢酶的编码基因（ldhA）和丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因（pflB）的敲除或失活，可以有效阻断甲酸、乳酸等副产物的生成使代谢流尽量向琥珀酸方向进行分配，有利于提高琥珀酸的产量和纯度[21]。但重组大肠杆菌在敲除ldhA和pflB 两段基因后，糖酵解过程中的NADH 无法及时再生为NAD+，导致厌氧条件下辅酶NAD(H)严重不平衡，丧失代谢葡萄糖的能力。所以平衡NADH 和NAD+之间的比例是琥珀酸发酵的一个重要调控策略。同时琥珀酸作为还原性终端产物，需要有足够的还原力才能推动代谢流向琥珀酸的转换，因此充足的NAD(H)也是必不可少的条件[20]。

图1 大肠杆菌厌氧混合酸发酵代谢网络Fig.1 Metabolic network of anaerobic fermentation for mixed acid by E.coli

2.1 NAD(H)的氧化还原态比例对琥珀酸发酵的 影响

实验研究证明过量表达NAD+依赖的关键酶可有效降低NADH/NAD+的比例，恢复重组大肠杆菌对葡萄糖的代谢，由于琥珀酸生产与菌体生长相偶联，因而是琥珀酸积累的必要条件。此类酶主要有：苹果酸酶、苹果酸脱氢酶、烟酸单核苷酸腺苷转移酶、烟酸转磷酸核糖激酶等[32-33]。梁丽亚等[9]通过少量IPTG 诱导重组大肠杆菌的苹果酸脱氢酶使其酶活提高为原来的14.8 倍，NADH/NAD+的比例下降59.4%，使重组菌在厌氧条件下能够正常代谢葡萄糖。苟冬梅等[32]过量表达了NAD(H)合成中的限速酶基因烟酸单核苷酸腺苷转移酶基因，使NADH/NAD+的比例下降36%，NAD(H)总量提升2.63 倍，同时减少了丙酮酸的积累有利于琥珀酸的大量合成。Stols 等[33]将大肠杆菌中NAD+依赖的苹果酸酶导入到E.coliNZN111 中并过量表达，在初始葡萄糖浓度为20 g·L-1下产生12.8 g·L-1琥珀酸，转化率达到64%。刘嵘明等[34]则构建了烟酸转磷酸核糖激酶的重组菌，在厌氧发酵中添加微量的烟酸和IPTG来诱导烟酸转磷酸核糖激酶过量表达，使辅酶NAD(H)的总量提升3.85 倍，NAD+的浓度提高了5.17 倍，重组菌在厌氧条件下恢复生长和代谢葡萄糖的能力。另外还有文献指出，在有氧阶段当碳源由葡萄糖替换为乙酸盐可对一些基因如aceBAk，mdh，pckA 等进行正调控，而与PEP 有关的基因如pstG，PtsHIccr，pyk 受到负调控，最终有利于NAD+的再生，使得氧化还原反应能持续进行，琥珀酸的产量也有较大提高[35]。

在厌氧发酵过程中，细胞内不同的氧化还原电位值（ORP）对 NADH 的代谢通量分布及NADH/NAD+的比例也有较为显著的影响[36]。但不同的菌株相适应的氧化还原电势范围不尽相同[37]。以Actinobacillus succinogenesNJ113 为例，由于2 mol NADH 才能生成1 mol 琥珀酸，造成NADH 的短缺，所以例如甲酸、乙酸这些不需要NADH 的副产物得以形成来维持胞内的氧化还原平衡。通过调节不同的ORP 水平，可以使代谢通路及某些关键酶的酶活发生变化，进而影响NADH/NAD+的比例。当ORP 在-350 mV 左右时可以使细胞中NADH 的总通量有明显增加，同时对琥珀酸的积累产生有利影响[38]。

2.2 NAD(H)水平对代谢通路的影响

琥珀酸厌氧发酵过程中碳源经糖酵解途径被逐级氧化将NAD还原为NADH；而在琥珀酸生成途径则将NADH 再生为NAD+，以维持氧化还原的平衡[39]。NAD(H)是生物生长代谢过程中的重要辅酶，在发酵过程中胞内NAD(H)浓度将对整个代谢网络产生极大的影响[40]。王桂兰等[10]通过利用不同的碳源做底物将过量表达苹果酸酶的重组大肠杆菌进行厌氧发酵时发现：还原性越强的碳源产生NADH 的量越多，发酵结束后琥珀酸产量也越高并且副产物乙酸等的产量越低。黄秀梅等[41]在产琥珀酸放线杆菌的厌氧发酵中外源添加0.5 g·L-1PEP，发现琥珀酸合成中的还原力得到补充，琥珀酸的产量也提高了11%，同时副产物的量也显著降低。

NAD(H)的循环再生是维持生物正常生长代谢的必要条件[42]，将甲酸脱氢酶应用于辅酶NADH的再生中可以在一定条件下有效维持辅酶的催化水平[26]。目前利用甲酸/甲酸脱氢酶体系来构建再生系统具有反应不可逆、成本低等优势，已经开始应用于工业化生产，其唯一副产物CO2不但可以维持一定的厌氧环境，而且有利于促进琥珀酸的生成[43]。Heuser 等[44]通过在大肠杆菌中过量表达烟酸转磷酸核糖激酶基因（pncB）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶基因（nadE）后，均使细胞中NAD(H)的总量增加了2 倍多，通过将这两个基因共同表达后，产生协同效应，使胞内的NAD(H)的总量增加了7倍多，琥珀酸的浓度也相应提高数倍。

研究发现，敲除大肠杆菌部分关键酶基因后会影响其在厌氧条件下正常代谢葡萄糖的能力，其关键在于NAD(H)氧化还原失衡导致[32]。已有报道证实通过将内源基因中的几个关键酶基因过量表达可以有效降低NADH/NAD+的比例[45]，与此同时，外源基因的引入和表达对改善NAD(H)平衡也取得了良好的效果。Stols 等[33]将猪蛔虫Ascaris suum中的苹果酸酶基因转入到E.coliNZN111，以及 Lin 等[45]通过在大肠杆菌中过量表达鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium中的烟酸转磷酸核糖激酶基因（pncB），也都达到了使NAD(H)的总量增加和NADH/NAD+比例降低的目的。菌体对葡萄糖的代谢得到恢复，由于琥珀酸积累和菌体生长代谢相偶联，使琥珀酸的浓度和累积速率均有明显的提高。

3 CO2 调控策略对代谢控制的影响

3.1 CO2 的作用及固定CO2 的代谢途径

生物法发酵生产琥珀酸中，CO2浓度是影响菌体生长和代谢的重要因素[46]。本质原因是CO2通常作为电子受体并通过浓度的变化来影响诸如PPC、PCK 和PYC 等涉及固定CO2的代谢途径中关键酶的酶活，进而影响C3向C4转化的代谢流[47]。琥珀酸发酵中的关键分支节点是PEP，琥珀酸的产量受PEP 在两条分支途径中分配率的直接影响。催化PEP 生成草酰乙酸（OAA）的关键酶PPC 和PCK均具有固定CO2的作用，理论上每摩尔琥珀酸的生成需要消耗1 mol 的CO2，但通过过量表达这些关键酶可以有效提高CO2的固定效率，增加向琥珀酸的代谢通量[48]。Okino 等[49]在研究高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌时发现，当培养基中加入碳酸氢盐后菌体的产酸速率和浓度都有所增加，且不同的碳酸盐浓度对菌体产酸的影响显著，可见琥珀酸的产量与CO2的浓度有密切的关系。虽然有报道指出，外加CO2对细胞的生长起消极作用，但对于琥珀酸的积累却具有显著提升，通过分析表明CO2对于PCK、PPC 和PYC 等都具有强烈的诱导作用，因此在琥珀酸发酵过程中，CO2的调控策略显得十分必要[50]。

3.2 CO2 的外源供给形式

琥珀酸发酵过程中CO2的外源供给形式主要有碳酸盐和CO2[14]。图2所示为CO2在发酵中的传递途径。碳酸盐通过与发酵液中所产生的有机酸反应释放CO2供菌体吸收，同时还可以调节发酵液中的pH。使用CO2气体时为保证发酵液中足够的溶解度，常需要通过加适量碱液来保持发酵液呈弱酸性。陈可泉等[51]通过考察A.succinogenesNJ113的发酵过程发现，CO2气体作为供体时菌体的生长、固定化CO2效率、琥珀酸产率等均优于碳酸盐。而Wang 等[50]的研究结果则表明在E.coli中，利用 HCO3-如NaHCO3和MgCO3比单纯通入CO2更有效，原因是 HCO3-对于PCK 的Km为13.0 mmol·L 而对于 PPC 为0.15 mmol·L-1，所以只有在高浓度的 HCO-3下才能促进PCK 的酶活，并且达到调节pH 的效果，更有利于琥珀酸的生产。Zhu 等[52]采用正交实验、最速上升法、响应面优化相结合的方法进行优化，发现气体CO2作为唯一供体时其分压对产酸并无较大影响，而当CO2与MgCO3以一定比例混合加入时，产酸值最大。

图2 CO2 在发酵中的传递途径Fig.2 Transmission of carbon dioxide in fermentation

3.3 CO2 的浓度及固定对发酵的影响

琥珀酸在生物法发酵过程中通常采用的是两阶段发酵的策略。即先在有氧环境中使菌体大量增长，然后通入CO2转厌氧进行发酵。其中在第二阶段CO2的供给不足会导致琥珀酸产量下降，副产物增多，所以保证CO2在发酵液中有足够的溶解度是保证琥珀酸产量的关键[51]。在生物固定CO2的过程中，影响CO2固定的因素有pH、CO2通气量、温度和搅拌速率等[53]。

pH 是影响CO2固定的重要因素。在琥珀酸发酵中，pH 主要通过影响CO2在发酵液中的溶解度及发酵液中碳酸的解离平衡，来影响菌体对CO2的利用度[54]。另外体系pH 的改变还会引起菌体内外部化学环境和酶活力的变化[55]。目前所报道的琥珀酸发酵的pH 适宜范围在6.2～7.2，在此条件下菌体的生长和产酸能力较高[56]。通过采用不同碱性金属离子作为琥珀酸放线杆菌A.ssuccinogenesNJ113 的pH 调节剂发现，Ca2+、NH4+对菌体生长代谢有较大阻碍作用，Na+的过量积累会增大发酵液中的渗透压，对细胞活性产生抑制作用，此外在发酵后期还会产生菌体絮凝的现象；而以Mg2+作为调节剂可增加PCK 的酶活，使整个发酵过程中菌体代谢旺盛，琥珀酸产量有明显提高，因此MgCO3是琥珀酸发酵时较好的碱性调节剂[54]。但由于MgCO3的成本高，耗量大，不符合工业发酵的经济性，所以有人通过采用混合碱NaOH 和Mg(OH)2或NaOH 和MgCO3等以适当比例进行发酵实验取得了很好的效果，并有效降低了发酵成本，具备工业化发展的潜力[23]。通气量水平直接影响发酵体系中CO2的溶解量，维持较高浓度的CO2通气量对菌体产酸具有有利影响。实验表明在恒定的CO2供给下，琥珀酸产率保持稳定同时菌体量也有所增加，可见CO2不仅参与产物合成，同时也是菌体生长的必要物质。温度不仅影响CO2的溶解度也调控着菌体生长代谢，不同菌体都有各自最适的温度值，在最适温度下CO2溶解度与菌体代谢相适宜，固定效率达到最高。搅拌转速影响CO2与培养液的传质速率，转速越大，CO2与培养液之间的传质速率越大，但当转速达到一定值时，CO2的固定速率达到相对稳定的水平[51]。

4 代谢通路的改造策略

大肠杆菌厌氧发酵琥珀酸是典型的混合酸发酵，至少存在6 条琥珀酸的合成途径[22]。在其代谢支路中，由PEP 经PCK 和PPC 羧化反应生成OAA，再到苹果酸、富马酸最后生成琥珀酸是大部分野生菌株发酵生产琥珀酸的主要途径。但通过对代谢通路中其他酶（如pncB）的调控、过量表达异源基因（如pyc）等控制策略，可以使其他代谢中间产物生成琥珀酸或其前体物，进而增加代谢通量，达到提升琥珀酸产量的目的[12]。

4.1 构建消耗丙酮酸的代谢通路去除反馈抑制

重组菌株在缺失pfl 和ldh 基因后，会造成丙酮酸的大量积累，反馈抑制了磷酸葡萄糖转移酶系统对葡萄糖的转运，使菌体在厌氧条件下不能利用葡萄糖，阻断了细胞的生长[57]。Wang 等[58]利用敲除了葡萄糖磷酸转移酶（ptsG）、乳酸脱氢酶（ldhA）、丙酮酸甲酸裂解酶（pflA）基因的大肠杆菌，并用乳糖诱导转入大肠杆菌的异源丙酮酸羧化酶基因（pyc）进行表达。通过外源引入丙酮酸羧化酶基因，可产生能分解丙酮酸的丙酮酸羧化酶，不仅解除丙酮酸大量积累形成的抑制，同时增加了一条由丙酮酸（PYR）到琥珀酸前体草酰乙酸（OAA）的代谢通路，使琥珀酸的产量得到进一步提高。利用乳糖代替IPTG 进行诱导，也降低了生产成本，有利于工业化生产。去除ldhA 和pflB 基因的工程菌通常造成辅酶的氧化还原不平衡而导致代谢终止，如果将烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB 和外源丙酮酸羧化酶基因pyc 一同导入到大肠杆菌中，一方面过量表达的pncB 使NADH/NAD+的比例明显降低，NAD(H)浓度增加，还原力得以加强；另一方面发酵过程中积累的丙酮酸通过丙酮酸羧化酶（PYC）的催化，生成了琥珀酸的前体物草酰乙酸，有效减少了副产物的比例，提高了琥珀酸的产量[59]。这种多基因调控对琥珀酸的生成具有协同调节的效果，有利于获得高产量、低副产物的工程菌株。此外还有通过共同表达泛酸激酶和丙酮酸羧化酶使琥珀酸产量得到提高的报道[50]。对于减少丙酮酸的积累还存在有其他途径，经研究测定苹果酸酶对苹果酸的Km值为0.4 mmol·L-1，而对丙酮酸的Km值为16 mmol·L-1，虽然在正常条件下一般催化丙酮酸到苹果酸的反应，但由于逆向反应在热力学上有利，所以也可以通过过量表达苹果酸酶，使得由于无法代谢而大量积累的丙酮酸通过逆向反应生成苹果酸，由苹果酸最终转化为琥珀酸，进而增加流向琥珀酸的碳通量[60]。

4.2 构建其他代谢通路促进琥珀酸积累

有研究发现，通过失活IclR 基因和ArcA 来使aceBAK 过量表达可形成一个新的琥珀酸代谢路 径——乙醛酸代谢途径（可以促进乙酰CoA 向琥珀酸的代谢）。原来发酵生产1 mol 琥珀酸需要消耗2 mol NADH，但以葡萄糖为底物产琥珀酸的过程中1 mol 葡萄糖理论上能够合成2 mol 琥珀酸，却只能生成2 mol NADH，所以还原力严重不足[28]。而通过乙醛酸代谢途径，1 mol OAA，2 mol 乙酰CoA和1 mol NADH 存在下可生成2 mol 琥珀酸，使NADH 与琥珀酸的比例降为1.25:1[61]。以上研究都是应用两阶段发酵或绝对厌氧发酵的条件来生产琥珀酸，同时有研究指出，大肠杆菌也可以利用有氧环境来通过乙醛酸途径代谢琥珀酸[30]。康振等[62]在将野生大肠杆菌分别敲除了琥珀酸脱氢酶（SDH），磷酸转乙酰基酶（Pta），丙酮酸氧化酶（PoxB），异柠檬酸裂解酶阻遏物（IclR）以及葡萄糖磷酸转移酶系统Ⅱ（PtsG）基因后，成功构建了可以好氧发酵琥珀酸的菌株，其主要原因是琥珀酸脱氢酶的SdhA 亚基可以阻断琥珀酸的氧化，因而使琥珀酸在三羧酸循环中得以积累。

5 结 语

利用代谢控制发酵生产琥珀酸存在不可替代的优势，具有巨大的生产潜力。当前对重组大肠杆菌及一些产琥珀酸菌株的代谢控制研究，主要集中于通过过量表达代谢途径中的关键酶，维持辅酶NAD(H)的氧化还原的平衡以及增加其浓度，增加代谢途径中的还原力，引入新的代谢途径等方面。重点对重组大肠杆菌的代谢进行调控操作，使琥珀酸成为生物代谢过程中的主产物，同时使其浓度和质量收率也达到较高的水平。但由于琥珀酸的积累和菌体的生长存在部分偶联效应，在对菌体进行代谢控制策略后会导致发酵周期延长，甚至需要进行两阶段发酵等问题，会在一定程度上限制琥珀酸的工业化生产。

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