γ-氨基丁酸代谢酶的研究进展

2015-08-20何梦秀陈芳艳钟杨生林健荣华南农业大学动物科学学院广东广州510642

安徽农业科学 2015年30期

何梦秀，陈芳艳，钟杨生，林健荣（华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642）

谷氨酸脱羧酶（Glutamic acid decarboxylase，GAD）是一种吡哆醛类裂解酶，广泛分布于动植物、微生物等各种有机体活细胞中。该酶能专一性催化L-谷氨酸（L-Glutamic acid，L-Glu）的α-羧基，发生脱羧反应，生成一种四碳非蛋白质氨基酸 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和 CO2。GABA是哺乳动物中枢神经系统中的抑制性神经递质，能与相应受体结合，在人体中发挥重要的生理功能［1］，如降血压［2－3］、调节生长激素的分泌、健肝利肾、促进睡眠、增强记忆力、改善脑机能、对癫痫的预防和治疗作用、镇痛安神、抗焦虑和抗衰老等［4］。这是由Roberts和Frankel于1950年首次在哺乳动物中发现。γ-氨基丁酸转氨酶（7-Aminobutyrate transaminase，GABA-T）在GABA分解代谢中起转氨基作用，在生物体内通常以磷酸吡哆醛为辅基，使GABA与丙酮酸发生α位的氨基转移，有利于GABA的分解。GAD和GABA-T是GABA代谢中的关键限速酶，受到人们的广泛关注。学者们对GAD的结构性质、分离纯化和在细胞中的定位与分布以及在哺乳动物神经系统中所起作用进行广泛、深入的研究。目前，该酶在生物体中的其他作用成为科学家的研究热点［5］。笔者对GAD的结构、酶学性质及其与GABA-T在GABA代谢过程中的作用进行综述。通过激活或抑制GABA代谢过程中的关键酶，使得材料中富集高含量的GABA。这对富含高GABA相关产品的开发利用提供参考。

1 γ-氨基丁酸的合成代谢

GAD催化Glu在α-位上的脱羧反应是合成GABA的主要途径。该反应是不可逆的，其具体过程［6］如下:GlutamateDG

ABA+CO2。在细菌和哺乳动物大脑中，GABA首先在GABA-T的催化下与丙酮酸反应生成琥珀酸半醛（SSA）和丙氨酸，然后琥珀酸半醛脱氢酶（Succinate semlalehyde dehydrogenase，SSADH）氧化SSA形成琥珀酸进入三羧酸循环。这些反应共同构成α-酮戊二酸氧化生成琥珀酸的代谢途径，即三羧酸循环的另一条支路，称为GABA支路（GABA shunt）。

从图1可以看出，GABA和SSA是该旁路的2个重要底物，对代谢调控起着重要作用。GAD、GABA-T和SSADH三种酶在GABA代谢旁路中起十分重要的作用，其中GABA的积累主要受GAD的调控，因此通过提高GAD酶活性或抑制GABA-T的酶活性均有利于GABA的富集。

2GAD的生物学性质

目前，科学家在微生物、植物、昆虫和哺乳动物中均发现GAD，例如微生物中的大肠杆菌［8－9］（E．coli）、曲霉［10］、乳酸菌［11－12］、酵母、变形杆菌属（Proteus vulgaris，P．morganii）及梭状芽孢杆菌属等都存在GAD［13］。由于微生物中富集GABA不受空间、环境和资源的限制，并且具有成本低、无化学残留和产量高等显著优势，进而被广泛地研究，并且被应用于材料GABA的积累。

2．1 GAD的结构特征已有学者对真核生物和原核生物中的GAD结构进行研究，并且就其结构与理化性质的差异进行探讨。研究表明，不同来源种属或亚种之间GAD结构与性质的关系存在一定差异。

大肠杆菌是最早发现的含有GAD酶的原核微生物。该菌具有较高的GAD酶活力，因此具有较高的富集GABA的能力。大肠杆菌GAD是由6个相同亚基组成的六聚体。每个亚基含1分子磷酸吡哆醛（PLP），辅酶与多肽链的赖氨酸残基共价结合组成的寡聚酶（一种六聚体［14］）。有研究表明，GAD存在2种同工酶［15］，分别被命名为GADα和GADβ。这些同工酶具有相似的一级结构，因N-末端的100个残基存在差异，使其在细胞定位和生理功能也有某些差异。Ueno等［16］在短乳杆菌IFO12005中研究发现纯GAD的N-末端氨基酸序列为M-N-K-N-D-Q-E-Q-T，与E．coliN-末端的M-DQ-K-L-L-T-D-F-R没有密切的相似之处，它们的分子量和Km存在差异，进而在生理功能上也有不同之处。根据GAD基因一级结构序列［17］，GAD单体由C末端结构域、5＇-磷酸吡哆醛结合区域以及N末端结构域三部分组成（图2）。

在植物体中GAD的结构与细菌中GAD的结构序列同源性较高，但结构分析显示，植物体GAD带有特殊的C-末端区域（钙调蛋白区域，CaM）。在逆境条件（如热刺激、缺氧和盐胁迫等）下，该末端可与CaM结合，调节GAD酶活性，大量积累GABA以促进植物生长［15］。据报道，具有底物抑制作用的大肠杆菌GAD残基上有L-丝氨酸-O-硫酸盐、R-y-4-氨基己-5-炔酸和一氟甲基－谷氨酸3个靶位点［18］。研究表明，靶点L-丝氨酸-O-硫酸盐的作用机制与天冬氨酸转氨酶相同。这为通过底物抑制酶系统应用于药物开发作出重要贡献［19］。

GAD在哺乳动物中存在GAD67与GAD65两种基因组，相应分子量分别为67和65 kDa，分别由Gad1和Gad2编码。相应的抗原性、细胞及亚细胞分布和与磷酸吡哆醛（PLP）相互作用等方面存在差异。

2．2 GAD的酶学性质据报道，通常微生物来源的GAD最适pH为3．8～5．0，在酸性介质中GAD的酶活力较强，当pH呈中性或偏碱性时其酶活力将消失。在原核微生物中，GAD与细胞生长的耐酸机制有关［15］。大肠杆菌具有酸诱导的氧化代谢系统、谷氨酸依赖型和精氨酸依赖型3种不同耐酸系统［20］，其中依赖谷氨酰胺酶YbaS和氨基酸反向转运蛋白GadC，可确保大肠杆菌在极酸性环境下生存［21］。Sanders等［22］研究发现，GadA、GadB和GadC是大肠杆菌抗酸系统中的重要组成部分。Lc．LactisGAD 在酸性（pH 3．6 ～5．4）条件下具有较高的酶活力，当pH为4．7时谷氨酸脱羧反应能力最高，当pH为6．0以上时其酶活力消失。这与GAD酶的诱导机制紧密相关［23］。酶与化学催化剂一样，其活性与温度有一定的依赖关系。不同微生物GAD的最适温度差异较大。这与其生长温度范围相关，大多在30～50℃之间。当温度低于最适温度时，酶促反应速度随温度的升高而增加;当温度超过最适温度时，反应速度随温度升高而下降［24］。在已报道的微生物GAD中Lc．LactisGAD的热稳定性相对较好。徐建军等［23］对乳酸菌GAD进行耐热性研究，发现在pH 4．7条件下处理5 h后，60℃时该酶仍能保持80%以上的活性，80℃以上则迅速失活。同时，试验还对微生物GAD酶具有高度的底物专一性进行检验，测试Lc．LactisGAD对18种常见氨基酸的脱羧作用，结果表明只有L-谷氨酸可作为其脱羧底物。来自植物、动物和微生物中的GAD尽管分子结构有较大差异，但同样具有很强的底物专一性。在一定的底物和PLP浓度下，体系中PLP的含量与反应速度呈正比。Km值是GAD与PLP的亲和力的反映，也是GAD的一个重要酶学特性常数［25］。

3 γ-氨基丁酸的富集

3．1 提高GAD酶活性的GABA富集测定酶活性中心组成和结构是研究酶催化作用的重要课题。目前，常用化学修饰法、反应动力学法和X-射线衍射法等激活或抑制酶活性。在GAD催化Glu合成GABA的代谢途径中，底物谷氨酸取代GAD上的赖氨酸残基，与5＇-磷酸吡哆醛辅因子形成一种醌结构，再通过质子化途径生成GABA及5＇-磷酸吡哆醛的再生。该合成途径需H+，被认为是一种pH调节机制。离体以及活体研究证实胞质的pH下降可激活GAD酶活性，并且有别于GABA的积累。金属离子常作为辅助因子参与酶促反应，在一定的浓度下对酶有激活和抑制作用，特别是重金属离子易使酶失活［26］。近年来，较多的研究发现Ca2+和Mg2+对GAD有较强的激活作用［27－28］。有研究表明，在pH 3．8的条件下，0．6 mol/L Ca2+和7．5 mol/L Mg2+对 GAD 酶活力有显著的提高作用（相对酶活分别为174%和164%），但两者为拮抗效应［29］。杨胜远等［27］在爬山虎茎中分离到5株内生菌，其中的菌株EJC-1具有GAD酶活性，且发现2．5 mmol/L Mg2+对GAD酶活力有显著的促进作用，其活力提高13．85%，但Ca2+对GAD酶活力影响并不大。这与王朝［29］研究结果有所差异。李云等［26］研究发现，Ca2+对GAD有显著的激活作用，Mg2+和Mn2+在较高浓度时激活作用明显，Co2+在较低浓度时激活作用较好。然而，Fe2+、Fe3+、Ag+、Cu2+和Zn2+对GAD 有抑制作用［27－28］，其中Cu2+和Zn2+对其酶活力的抑制作用显著［30］。据报道，Na+和Cl-既不是GAD的激活剂又不是抑制剂，而Li+和K+对GAD活性有轻微的抑制作用［31］。由此可知，不同来源的GAD酶活性差异较大。因此，不同金属离子对GAD酶活力的影响力均不同，但Ca2+和Mg2+均可激活GAD的酶活性，并且增强其酶促反应，有利于GABA含量的积累。对于GAD酶抑制剂，它可在酶促反应中添加络合剂，使其与金属离子形成螯合物，减少金属离子含量，从而缓解其对GAD酶的抑制作用。

微生物具有代谢快的特征，因此其寿命较短暂。这一缺陷限制了酶促反应的广泛应用。在20世纪60年代发展起来的酶和活细胞的固定化技术可以提高酶的稳定性，延长半衰期，在较长时间内反复使用，有利于生产上工艺的连续化和管道化，避免自由酶在应用上的缺陷。目前，已有较多采用固定化GAD转化制备GABA的研究报道［32－34］。陈蔚青等［35］以海藻酸钠与明胶的协同作用为载体包埋固定化GAD，以谷氨酸为底物，以固定化GAD为催化剂，采取生物转化法连续制备GABA 60 h，使得GAD酶活性持续时间延长，其稳定性显著增加，Glu转化率高达98．7%。王筱婧等［36］用海藻酸钠固定米糠中的GAD，固定化后GAD的最适温度由40℃左右上调至45℃左右，但其性质未发生改变，酶活力大大升高，经固定化米糠GAD方法制备得到的制备液中GABA含量占可溶性固形物含量的3．06%，与未固定化米糠GAD制备的GABA含量2．84%相比明显提高，且可溶性蛋白和总糖含量大为下降。固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的技术。与固定化酶相比，固定化细胞可省去酶的分离手续，进行连续发酵，同时细胞生长快，对污染因子的抵抗力增加。韩雪［37］采用海藻酸钠－氯化钙包埋法对从酸菜中分离、纯化的植物乳杆菌进行固定化。固定化细胞在一定程度上能减小底物的抑制作用，与游离细胞中GAD的最适pH 4．7相比固定化细胞在pH为4～5时均有较高活性，扩大了GAD酶发生作用的pH范围，经连续7次转化后固定化细胞中GAD的活力仍为初始酶活力的68．3%，且菌液中GABA的积累量可达7．065 g/L。

3．2 抑制GABA-T酶活性的GABA富集与GAD不同，GABA-T被广泛分布于各种组织中，并且与PLP的结合更加紧密。研究表明，被纯化GABA-T的最适pH为8．2，且不耐热，在25℃时90 min开始失活，在30℃时60 min开始失活，但酶失活前反应温度30℃比25℃酶活性高［38］，但该酶需要PLP作为辅酶，其对 GABA的Km值为1．1 mmol/L。朱莉等［39］利用酶活法测定苏云金芽孢杆菌GO3菌株中的GabT和GabD蛋白，发现这2种蛋白分别呈现出GABA-T和SSADH的活性。γ-氨基丁酸可利用丙酮酸或α-酮戊二酸作为氨基接受体，催化GABA和琥珀酸半醛之间的可逆转变。GABA-T是GABA代谢的关键限速酶，也是中枢神经系统药物的靶点，其活力的改变直接影响GABA水平。当GABA-T受到抑制时中枢神经系统内GABA含量显著升高，进而有利于多种神经系统疾病的治疗。为了增加GABA浓度，可设计一种通过血脑屏障的GABA-T抑制剂［40］，目前，GABA-T抑制剂主要是GABA类似物，也包括少量的特殊结构的化合物。现已合成大量的抑制剂，包括竞争性抑制剂和基于机制的不可逆抑制剂，如Vigabatrin类似物、取代氨基戊酸类似物和取代氨基丁烯酸类似物等。有研究表明，乙体氯氰菊酯可显著降低小鼠脑组织中GABA-T的酶活力，促使GABA含量增多，导致Glu/GABA 平衡紊乱［41－42］。黄酮类化合物也能明显地以剂量依赖的方式抑制GABA-T和SSADH酶活力，属于非竞争性抑制，并且表现出不同的构效关系［40］。

GAD和GABA-T是维持脑中GABA含量的2个主要代谢酶。两者的协同作用对保持神经递质GABA浓度有重要意义［43］。梁统等［44］以丙戊酸钠为原料，对大鼠大脑皮层4个脑区中GAD、GABA和GABA-T含量的变化进行研究。研究表明，丙戊酸钠既是GABA-T的抑制剂，又能激活GAD，可显著提高GABA含量。

4 展望

GAD在真菌孢子的萌发过程中起代谢调节作用［45］。GAD酶活力的提高有利于催熟香蕉［46］，并且可促进GABA的积累以缓解低氧胁迫对植物的伤害［47］。研究表明，在医学上，GAD抗体是反映1型糖尿病胰岛B细胞自身抗体的免疫学指标，具有重要的临床意义［48］。在生产应用上，通过激活GAD或抑制GABA-T酶活力合成GABA，其生物合成条件温和、原材料廉价、工艺简单、生产周期短、安全性高且不受资源、环境和空间的限制，因此采取生物合成法富集GABA被广泛应用于农业、食品和药品行业，具有广阔的市场前景。γ-氨基丁酸茶在日本已被大力开发，其产品受到广大消费者特别是高血压患者的亲睐，已开发出叶茶、袋泡茶和灌装茶饮料等系列产品。随着广大消费者对保健品需求的日益增长以及对GABA的药理功效的了解深入，目前开发出的富含γ-氨基丁酸的产品必定具有广阔的市场前景。然而，在动植物中GABA含量很少，且随着年龄的增长，人体所含的GABA含量有所降低，因此科学家们需要进一步地研究、探索富集高γ-氨基丁酸的技术。该实验室通过物理和微生物学的方法来富集GABA，为生产高含量γ-氨基丁酸产品提供参考。

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