白芍提取物对MPTP致帕金森病小鼠的保护作用及机制的研究

郑梅竹等

摘要：为了探讨白芍（Radix paeoniae Alba）提取物对MPTP（1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶）致帕金森病小鼠的保护作用，试验采用不同剂量的白芍提取物（0.75、1.50、3.00 g生药/kg体重）灌喂小鼠，每日一次，连续15 d。第八天起所有小鼠每日腹腔注射MPTP 1次共8次，建立小鼠帕金森病（Parkinsons disease，PD）模型，通过检测小鼠的自主活动、爬杆能力、滚轴能力及悬挂能力等行为学表现，同时检测小鼠脑黑质中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）水平的变化来评价白芍提取物对PD小鼠的影响。结果显示，经MPTP诱导的小鼠，其自主活动次数显著减少、爬杆时间差值显著增加、附着能力评分显著降低；经高剂量白芍提取物预处理后能显著（P<0.05）增加小鼠在测试时间内的自发站立次数，显著（P<0.05）缩短爬杆时间差值，显著（P<0.05）提高附着能力分值，极显著（P<0.01）提高小鼠脑内SOD、GSH-Px水平，MDA水平极显著（P<0.01）。

关键词：白芍（Radix paeoniae Alba）提取物；帕金森病（PD）；小鼠；氧化应激

中图分类号：R742.5；R285.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）12-2960-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.039

Neuroprotective Effect and Mechanism of Radix paeoniae alba Extracts Against MPTP-induced Mouse Model of Parkinsons Disease

ZHENG Mei-zhua，FAN Ya-junb，SHI Dong-fanga，ZHANG Yu-chia，LIU Chun-minga，WANG Yue-qia，REN Jun-qia

（Changchun Normal University，a.The Central Laboratory；b.The College of life Science， Changchun 130032， China）

Abstract：For studying the neuroprotective effect of Radix paeoniae Alba extracts against MPTP-induced mouse model of Parkinsons disease （PD） and its mechanism， 60 mice were randomly indiveded to 6 groups， such as nomal control group， model conrol group， positive medicine control group， and three trial groups which treated with Radix Paeoniae Alba extracts of different dots （0.75、1.50、3.00 g/kg，i.g.） for 15 days. At the 8th day， the mice except of the nomal control group were started intraperitoneal injection with MPTP（3.00 g/kg，i.p.） for eight days and the subsequent behavioral testing of mice， such as voluntory movement， rotarod test， pole test and traction test was assessed. SOD、GSH-Px and MDA levels in mouse striatum nigra were measured using analysis Kit. The results showed that the MPTP-induced mice presented typical Parkinsons disease such as voluntory movement significantly decreased， the time difference of climbing pole， significantly increased and the adherence ability assessment significantly decreased， etc. But after pretreated Radix paeoniae Alba extracts， the abnormal behavior including the decrease in spontaneous motor activity and the prolongation in the pole test latent period induced by MPTP were all significantly improved（P<0.05）.In addition， Radix Paeoniae Alba extracts significantly inhibited the oxidative stress level， such as decreased the level of MDA （P<0.01） and increased the antioxidant enzyme GSH-Px（P<0.05） and SOD activity（P<0.05）.

Key words：Radix paeoniae Alba；Parkinsons disease （PD）；mouse；oxidative stress

开发新型、高效、低毒副作用的帕金森病（Parkinsons disease，PD）药物始终是精神药理学的一个重要研究课题，因此从天然药物中寻找高效抗PD制剂成为近几年一个新的研究方向。

白芍（Radix paeoniae Alba）为毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall） 的干燥根，在中国北方地区分布广泛。有养血、益气、止痹、通络的作用，是风湿类疾病、自身免疫病、肝炎及肝硬化治疗中重要的组方之一，受到医药学界的广泛重视。现代药理学表明白芍提取物可改善东莨菪碱所致小鼠的学习记忆障碍，并能增强大鼠的学习能力。研究发现，芍药总苷对大鼠皮层神经细胞缺氧、缺糖、氧自由基及NO神经毒性等损伤有显著保护作用[1]。

PD的发病机制机理有环境和基因两方面的因素，临床研究表明，PD患者处于氧化应激状态，氧化应激反应是PD的发病机制之一[2]，在各种神经变性机制中，氧化应激占据主导地位，并对多巴胺神经元死亡起重要作用[3]。

因此，本研究采用经典PD动物模型对白芍提取物的抗PD作用进行了初步评价，以探讨白芍提取物对MPTP（1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶）致PD小鼠脑组织氧化损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品和试剂 白芍提取物，由长春师范大学中心实验室提供，提取率为3.84%，其中芍药苷、没食水酰基芍药苷和苯甲酰基芍药苷含量分别为21%、14%、26%；美多芭（多巴丝肼片），上海罗氏制药有限公司，批号SH1484；MPTP，上海德默医药科技有限公司，批号20131215；单胺氧化酶测定试剂盒、乙酰胆碱酯酶检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 仪器 YLS-4C型转棒式疲劳仪、YLS-3TB型跳台记录仪，济南益延科技开发有限公司；ZZ-6型小动物自主活动仪，成都泰盟软件有限公司；EXL 808型酶标仪，BioTek instruments Inc。

1.1.3 试验动物 雄性ICR小鼠，体重18～22 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司， 许可证号：SCXK（京）2009-0004。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和给药方法 60只小鼠随机分为6组，即正常对照组（空白对照组），模型对照组，阳性药物对照组（美多芭，100 mg/kg体重），白芍提取物低、中、高剂量组（分别按0.75、1.50、3.00 g生药/kg体重给药），每组10只。均按20 mL/kg体重经口灌胃给药（正常对照组和模型对照组按20 mL/kg体重给予双蒸水），每天1次，连续15 d。从第八天开始，除空白对照组外所有试验小鼠均腹腔注射MPTP[30 mg/（kg·d）]，每天1次，共8次。最后一次注射MPTP 10 min后，模型对照组小鼠应出现前肢抬举伴震颤、后肢僵硬、竖尾、竖毛及跳、蹿等动作， 持续约30 min后， 出现短暂性活动减少；注射MPTP 1 h后进行以下行为学指标检测：自发活动试验、爬杆试验、滚轴试验和悬挂试验。

1.2.2 自发活动试验 使用小鼠自主活动仪测定小鼠自发活动并计数，将小鼠放入自主活动箱中（高13 cm、直径25 cm，每个活动箱中放1只小鼠，每次同时测定4只小鼠），由记录仪自动记录小鼠活动，测定前每只小鼠先自由活动3 min，然后测定每只小鼠5 min内的活动次数。

1.2.3 爬杆试验 将一直径为2.5 cm的软木小球固定于一根长50 cm、直径1 cm的木杆顶端，木杆上缠上纱布以防打滑，作为爬杆。试验期间，每天引导小鼠从杆顶爬到杆底，每天2次。测试时将被测小鼠置于软木小球上，记录小鼠爬到杆底所需要的时间并作统计学分析，超过60 s的以60 s计。在给药前先测定所有小鼠爬杆时间，并在末次腹腔注射MPTP后1 h再次测定其爬杆时间，每只小鼠测3次取平均值。以末次给药后爬杆时间减去给药前爬杆时间的差值作为衡量小鼠因MPTP引起肢体协调能力下降程度的指标。

1.2.4 滚轴试验 滚轴试验需要动物在滚轴上保持平衡并连续运动，是广泛采用的检测运动协调性的试验。使用YLS-4C型小鼠转棒式疲劳仪测试小鼠的转棒行为表现。将小鼠置于转棒上，转速为16 r/min，测试小鼠从转棒开始旋转到离开转棒的时间作为小鼠转棒潜伏期，测试时间为180 s，每只小鼠测3次取平均值。测试前连续训练3 d，每天2次。

1.2.5 悬挂试验 在试验期间，每天将受试小鼠两前爪悬挂于一根水平金属线上（直径1 mm，距地面30 cm）停留10 s，每天2次。于小鼠末次腹腔注射MPTP 1.5 h后进行测试。小鼠悬挂能力评分标准：小鼠用两后爪抓住金属线记3分，用一后爪抓住金属线记2分，两后爪均抓不住金属线记1分，最后计算得分情况并记录小鼠从金属线上掉下的时间。

1.2.6 小鼠脑组织超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）含量测定 试验结束后，各组小鼠断头取脑，分离中脑黑质。制备脑组织匀浆液，取适量上清液进行SOD、GSH-Px、MDA的检测，具体方法参考检测试剂盒说明书步骤进行。

1.2.7 数据处理 试验数据均以x±s表示， 用ANOVA 进行统计学检验， 组间比较P<0.05视为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 自发活动试验

由表1可见，与正常对照组比较，模型对照组小鼠自发活动次数和自发站立次数显著（P<0.01）减少，说明造模成功；与模型对照组比较，白芍提取物高剂量组小鼠自发站立次数显著（P<0.05）增加。

2.2 爬杆试验

由表2可见，与正常对照组比较，模型对照组小鼠爬杆时间极显著（P<0.01）延长；与模型对照组比较，白芍提取物高剂量组小鼠爬杆时间显著（P<0.05）缩短。

2.3 滚轴试验

由表3可见，与正常对照组比较，模型对照组小鼠滚轴时间极显著（P<0.01）缩短；与模型对照组比较，白芍提取物低、中、高剂量组小鼠滚轴时间极显著（P<0.01）增加。

2.4 悬挂试验

由表4可见，与正常对照组比较，模型对照组小鼠悬挂时间极显著（P<0.01）缩短；与模型对照组比较，白芍提取物高剂量组小鼠悬挂时间显著（P<0.05）延长。

2.5 小鼠脑组织SOD、GSH-Px活性及MDA水平的检测

由表5可见，与正常对照组比较，模型对照组小鼠脑组织的SOD和GSH-Px活性极显著（P<0.01）降低，而MDA含量极显著（P<0.01）升高；与模型对照组比较，白芍提取物高剂量组小鼠脑组织SOD、GSH-Px活性极显著（P<0.01）升高，MDA水平极显著（P<0.01）下降。

3 小结与讨论

用MPTP制备的C57BL/6J小鼠模型是国内外公认的PD动物模型之一，已被广泛用于PD的研究中。本试验利用MPTP腹腔注射成功复制了C57BL/6J小鼠PD模型，小鼠的行为学及临床表现方面都与PD患者相近[4-7]。由于PD临床症状以静止性肌肉震颤、运动迟缓、肌张力增高及姿势平衡障碍等为主要特征，故本试验中设计了白芍提取物对小鼠自主活动、爬杆能力、滚轴能力、悬挂能力的影响，以研究其是否具有增加自主活动及改善肢体运动协调能力的作用。自主活动反映了动物的随意运动能力和中枢神经系统的兴奋程度，当中枢神经系统兴奋时，自主活动增多；反之，自主活动减少。在本试验中以自主活动次数作为反映自主活动的客观指标，发现与模型对照组比较，白芍提取物高剂量组（3.00 g/kg）能够显著增加小鼠在测试时间内的自发站立次数，提示白芍提取物能部分拮抗小鼠因腹腔注射MPTP导致的自主活动减少，提高中枢神经系统兴奋程度及随意运动能力。爬杆试验、滚轴试验与悬挂试验能反映动物肢体运动协调能力，协调性好则动物爬杆所需时间短、附着能力强，反之，爬杆所需时间长、附着能力弱。研究发现腹腔注射MTPT 8次后，与正常对照组比较，模型对照组爬杆时间差值显著增加、附着能力评分显著降低，表明小鼠肢体运动协调能力严重受损。白芍提取物能明显缩短小鼠爬杆时间差值并提高附着能力分值，提示白芍提取物能够提高小鼠肢体运动协调能力，对PD动物模型具有保护作用。

有关PD的发病机制至今尚不清楚。研究表明，氧化应激与PD发病密切相关。PD患者处于氧化应激状态，脑黑质中过氧化物比正常人增加10倍，血清MDA含量增加；黑质纹状体中GSH活性显著降低，脑中水解酶、GSH-Px的活性明显降低[8]。本研究使用MPTP制备PD模型，采用白芍提取物给药15 d后，PD小鼠脑内SOD和GSH-Px活性与模型对照组相比明显提高（P<0.05或P<0.01），而其MDA的含量较模型对照组明显下降（P<0.05或P<0.01），这些结果提示，白芍提取物可能通过抑制氧化损伤来起到保护多巴胺能神经元的作用。

该结果为进一步研究白芍提取物的抗PD机制奠定了基础，同时为在白芍中研发新型抗PD药物提供了有力依据。

参考文献：

[1] 楚正绪，沈洪兴，竺 青，等.赤芍提取物改善学习记忆的作用[J].第二军医大学学报，1991，12（5）：465-468.

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[3] 武 倩，叶 敏，蒲小平.中药提取物CTE对MPTP所致帕金森病小鼠模型的神经保护作用[J].中国新药杂志，2011，20（4）：355-358.

[4] SUNDSTROM E. Chornic neurochmical and behavioral changes in MPTP-lesioned C57BL mice：a model for Parkinsonc's disease[J]. Brain Res，1990，528：181-188.

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[8] MARINO M J，WILLIAMS D L ，O′BRIEN J A，et al.Allosteric modulation of group III metabotropic glutamate receptor 4： a potential approach to Parkinson′s disease treatment[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2003，100（23）：13668-13673.