芽孢杆菌脂肽类抗生素的研究进展

熊汉琴等

摘要：脂肽类抗生素是芽孢杆菌产生的一类天然农用抗生素，具有广谱、高效、安全无毒、不易产生耐药性等优点，在芽孢杆菌生物防治方面发挥着重要作用。综述了目前国内外对脂肽类抗生素研究所取得的重要进展，包括脂肽类抗生素的种类和特性、快速分离鉴定、纯品制备、基因改造和发酵工艺优化等，并对脂肽类抗生素的研究前景进行了展望。

关键词：脂肽类抗生素；分离；鉴定；纯化；发酵

中图分类号：Q939.92 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）12-2817-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.001

Advances of Lipopeptides in Bacillus

XIONG Han-qin， CAI Yan-fei， GUO Zhen-zhen， ZHANG Ya-ya， CAO Yu

（South China Agricultural University， College of resources and enviroment， Guangzhou 510642， China）

Abstract：The lipopeptide from Bacillus is a kind of natural agricultural antibiotic and plays an important role in the biological control，duing to the advantages of broad-spectrum，efficient， non-toxic and so on.We reviewed the significant progress on lipopeptide，including the characters，isolation and identification， preparation of the pure product，genetic modification and optimization of the fermentation process. In addition，the potential application of lipopeptide are finally presented.

key words： lipopetides；isolation； identification；purification；fermentation

芽孢杆菌是一类能产耐高温、抗逆的芽孢，在很多恶劣的生态环境中均能生长，且具有数量多、分布广、繁殖快、竞争定殖能力强等特点的生防菌株，适合工业菌剂的生产，日益成为植物病害生物防治控制的重要研究对象。据统计，在全球细菌类生防菌剂产品中，芽孢杆菌占市场销售额的70%以上[1]。采用芽孢杆菌生物防治技术来控制作物土传病害得到日益重视[2，3]。芽孢杆菌对多种作物病害显示出较好的控制效果，其抑制植物病害的机制复杂，如通过成功定殖在植物根际、体表或体内，与病原菌竞争周围的空间和营养位点，分泌抗生素、细菌素、系统防御酶等抗菌物质，促进植物吸收更多的氮、磷、钾，诱导植物产生系统抗性抵御病原菌入侵等。尤其是分泌脂肽类抗生素已被认为是其抑制植物病害的重要因素[4，5]。自1968年Arima等[6]在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵液中首次发现Surfactin以来，不断有新的脂肽类抗生素生产菌株被报道在生防控制中起重要作用，并且其田间防治效果良好。Moyne等[7]从枯草芽孢杆菌AU195发酵液中鉴定了2种Bacillomycin D的同系物，对黄曲霉Aspergillus flavus具有很强的抑菌作用；Guo等[8]发现生防枯草芽孢杆菌NCD-2的主要抗菌物质为Fengycin。美国Taensa公司研发的解淀粉芽孢杆菌FZB42和AS43.3主要用于防治根腐病和赤霉病，日本东京研究所研发的枯草芽孢杆菌RB14主要用于防治枯萎病，中国东北农业大学枯草芽孢杆菌B006脂肽类抗生素主要用于防治黄瓜枯萎病。脂肽类抗生素因其具有广谱、高效、安全无毒、不易产生耐药性等优点而备受食品化妆品行业、医药行业、农业等相关行业的青睐，尤其成为国内外在生物防治方面研究的重点。本文综述了芽孢杆菌脂肽类抗生素的种类和特性、快速分离、鉴定及纯品制备的方法、基因改造和发酵工艺优化等研究进展，并对其未来的研究前景进行了展望。

1 脂肽类抗生素的种类和特性

脂肽类抗生素根据其结构上的差异分为Surfactin、Iturin、Fengycin A或B等三大家族和一些结构未知的环肽抗生素[9]。Surfactin家族的脂肽类化合物是由7个氨基酸的肽链与β-羟基脂肪酸链（C13-C16）交联形成的内酯环状结构[10]，是目前认为较好的生物表面活性剂，具有很强的乳化和发泡作用，可以破坏细胞膜，猜测是其三维结构在起作用，具有很好的抗病毒、溶血、抗支原体和抗细菌的作用[11，12]，对真菌没有太大的抑制作用，但有研究发现能够增强Fengycin或Iturin对真菌的抑制效果，还能在植物根部形成一层生物膜（Biofilm）保护植物根部免受病原菌的入侵[13]。Iturin家族的抗菌脂肽由七肽与β-氨基脂肪酸链通过酰胺键相连而成，主要分为IturinA、B、C、D，也具有较强的溶血活性，但其生理活性与Surfactin不一样，Iturin对酵母菌和真菌有很强的抑制作用，而对细菌的抑菌活性是微弱的。Iturin主要是通过在真菌细胞膜上形成传导离子的小孔来影响真菌细胞膜的通透性，细胞膜的渗透能力被改变，有研究表明Iturin能与甾醇类物质强烈作用形成Iturin/胆固醇的复合物[14]，通过分裂酵母细胞质膜产生小囊泡来影响酵母的生长[15]。Fengycin家族由β-羟基脂肪酸链（C14-C18）和10个氨基酸残基的小肽组成的双亲分子，对丝状真菌有很好的抑制作用，而对酵母和细菌无效，溶血作用比Surfactin和Iturin要弱，能抑制芳香酶（Aromatase）和磷脂酶A2的活性[16]。endprint

2 脂肽类抗生素的快速分离鉴定研究进展

目前对脂肽类抗生素分离鉴定的常规手段是采用沉淀、萃取、层析、高效液相色谱等方法。由于脂肽类抗生素具有耐强酸的性质，采用浓盐酸沉淀是有效的手段之一。萃取是将脂肽类抗生素溶解在某一溶剂中，进一步分离目标产物，常采用的溶剂有甲醇、乙醇、氯仿/甲醇等，其中甲醇是使用最多的溶剂，其能溶解大多数脂肽抗生素。层析是为了进一步将不同类的脂肽抗生素分离纯化，包括薄层层析（TLC）、凝胶色谱层析（GPC）等，利用脂肽抗生素标样的迁移率来推测脂肽抗生素的种类，最后采用高效液相色谱法（HPLC）对脂肽类抗生素标样和分离的目标产物进行定性和定量对比分析，从而确定各类脂肽类抗生素同系物的种类和产量。

抗菌活性物质的合成与芽孢杆菌的功能基因有关[17]。Joshi等[18]报道表面活性素合成的基因（SrfAA、SrfAB）、伊枯菌素合成的基因（ituA、ituB、ituC、ituD）、丰原素合成的基因（fenB、fenD）、假定蛋白合成的基因（yndj、yngG）和枯草蛋白酶合成的基因（qk）。因此将生防菌DNA进行功能基因PCR，快速预测其可能代谢的抗生素种类，并采用不同的发酵、分离纯化方法，对提高抗生素分离鉴定试验的针对性和成功率具有重要的意义。曹云[19]利用抗生素合成基因的专化引物PCR扩增生防菌SQR 9基因组DNA，快速检测其携带的抗生素合成基因种类，采用HPLC等度洗脱，将分离的抑菌活性物质经HPLC-ESI-MS系统分析鉴定其成分，发现菌株SQR 9含有Bacillomycin和Fengycin 2种脂肽类抗生素[20]。Ye等[21]采用酸沉淀、甲醇提取和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS/MS）方法分析，鉴定枯草芽孢杆菌B47发酵液的主要成分为Iturin。LC-ESI-MS等技术是一项检测已知结构化合物的功能强大的新技术，但芽孢杆菌抗菌的次生代谢产物复杂多样，存在许多结构未知的抗菌活性物质尚未鉴定，高效液相色谱—核磁共振波谱联用（HPLC-NMR）技术为芽孢杆菌未知抗菌物质的鉴定提供了很好的手段[22]。

3 脂肽类抗生素纯品制备的研究进展

脂肽类抗生素具有广阔的应用前景，但其尚未得到广泛的研究和应用，主要是因为生防芽孢杆菌产生的脂肽类抗生素种类和同系物繁多、量少，发酵液中成分又复杂，难以制备纯品和大规模生产，有些甚至还没有标准的检测方法报道。分离制备纯品的成本很高，目前在国内还买不到纯品，在Sigma公司只能买到Surfactin和Iturin A的纯品，Surfactin≥98%（HPLC and TLC）和Iturin A≥95%（HPLC）的价格分别为10 mg 2 361.06 RMB和1 mg 1 532.70 RMB，严重限制了其广泛研究和应用。

龚庆伟[23]将芽孢杆菌发酵液经过离心、酸沉淀、有机溶剂提取等步骤得到抗菌脂肽Surfactin、Fengycin粗提物，再通过硅胶柱层析进行初步的纯化，最后过制备色谱纯化得到纯品，并经过抑菌试验、HPLC、LC-MS、MS-MS分析其纯度较高，建立了一种准确定量检测抗菌脂肽含量和制备其纯品的方法，但成本昂贵，只适合实验室制备少量纯品以供研究，不能适应商业化大规模的生产，因此本文结合现有的研究方法，从基因改造和发酵工艺优化两个方面对提高脂肽类抗生素产量进行了综述，为进一步探究更加简便、快速、低成本、大批量分离制备其纯品提供理论和实践依据。

3.1 基因改造

近年来随着芽孢杆菌全基因组测序的完成，越来越多的抗菌脂肽的合成机制得以阐明，大量相关基因被克隆、分析，获得了脂肽类抗生素合成和调控的遗传信息[24]。周田甜[5]将生防菌Pseudomonas fluomscens的负调控基因phlF敲除，提高了菌株合成2，4-DAPG的能力并增强了抑菌活性，pWF缺失突变也增强了其在根际的竞争力；Lee等[25]利用LA-PCR技术将32 kb长度的Surfactin操纵子srfA扩增后连接到pIndigo BAC 536载体，将载体转入E.coli DH10B获得转化子E.coli ET2，其代谢产物经TLC分析证实含有Surfactin。Ohno等[26]将Bacillus subtilis RB14基因组中表面活性素合成必需基因lpa14连接到pC112载体，然后将其转导进入另一枯草芽孢杆菌获得Bacillus subtilis MI113基因工程菌，该菌在37 ℃发酵产生Surfactin的量是Bacillus subtilis RB14产生量的8倍。对生防菌株基因修饰改造，是一种获得高产量脂肽类抗生素的有效手段，将不同功能基因的基因簇整合到其他生防菌株基因组中，有望构建产多种抗生素的工程菌株。

3.2 发酵工艺优化

芽孢杆菌合成次级代谢产物的能力与外界环境和营养条件密切相关，发酵工艺条件的优化与否直接影响代谢方式，从而影响目的产物的种类和产量[27]。在有些发酵中营养缺乏是抗生素开始合成的条件，比如当碳源或氮源的量成为一个限制性因素，菌体的生长就会迅速减慢，从而开启次级代谢产物抗生素的合成途径，而且在不同的发酵培养时间下分泌的抗菌素种类不同，通常在指数生长期向稳定生长期过渡的过程中产生大量Surfactin，在稳定生长期的早期产生Fengycin，在更加靠后的时间段内产生伊枯菌素[28，29]。He等[30]在发酵温度26.3 ℃，初始pH 6.0，装液量72.4%，转速150 r/min，接种量5%，发酵周期2 d的条件下获得最大的抗生素产量。Zhu等[31]采用响应曲面试验设计，在豆粕5 g、稻草4 g、pH 7.0、2%麦芽糖和2.65%甘油培养条件下，解淀粉芽孢杆菌XZ-173产生的Surfactin最高，为15.03 mg/gds。因此优化发酵工艺是提高发酵水平的重要途径，对稳定代谢产物中的成分、降低发酵成本、提高抑菌活性物质产率具有重要的意义，为规模化生产奠定基础。针对不同脂肽类抗生素纯品的制备，调节生防菌株的发酵培养基和工艺条件，以期在不同的环境和营养下得到相对专一的代谢抗菌物质并获得最高产量，为脂肽类抗生素纯品的大量制备提供前提条件和物质基础，从而获得更加简便、快速、低成本、大批量分离制备其纯品的方法。endprint

4 问题与展望

4.1 探究影响抗生素以及相关功能基因表达的土壤因子

生防芽孢杆菌在植物根际定殖是一个复杂过程，受到植物和微生物间相互作用以及多个环境因素的影响，现阶段大都停留在室内或盆栽植物根际中研究菌株的定殖机制，而实际的土壤环境因子远比人工培养条件要复杂，因此得出的结论还不能证明在田间也能有较好的生防效果，土壤因子能诱导或抑制防病相关基因和一些潜在的功能基因表达[32，33]。土壤中的贫营养环境胁迫很可能调控芽孢杆菌的生理状态，使之有利于抗菌物质的合成。Szczech等[34]研究发现在种植番茄土壤中施用RB14菌剂后，土壤Iturin抗生素浓度逐渐增加。周田甜[5]对筛选的生防菌Pseudomonas fluomscens利用基因修饰手段，使得2，4-DAPG产量提高，但并未显著增强菌株在盆栽试验中对番茄青枯病的生防效果，可能是由于土壤中营养物质、温度和水分的不恰当，导致拮抗物质合成受到抑制；另外土壤颗粒成分吸附菌株产生的抗生素，使2，4-DAPG在根际作用的有效浓度降低，也可能是影响实际生防效果的原因。因此，有必要研究芽孢杆菌施入土壤后，起生防作用的主要抗菌物质及其相关基因表达量的变化规律。分析土壤因子对生防菌株脂肽类抗生素合成的影响，筛选实际土壤中产生显著生防效果的主要芽孢杆菌抗菌物质种类和含量及其关键功能基因，优化土壤条件因子；采用定量PCR、GFP标记等技术探明影响抗生素功能基因表达的土壤环境因子，是今后研究工作的重点和难点，以期为芽孢杆菌田间生防潜力稳定发挥提供科学依据。

4.2 挖掘更多潜在的天然新型农用抗生素

这些已知抗菌基因研究进展揭示了一定的生防机理，但仅局限在少量的几种防病相关基因表达调控研究。而芽孢杆菌基因组中有4%～5%的抗菌相关基因，还蕴藏着大量未知的抗菌活性物质及其潜在的相关基因[35，36]。近年来全基因组测序的快速发展为发现更多潜在的天然新型农用抗生素的研究提供了更有效全面的手段[32，37]。对生防菌株进行全基因组测序，对已知的和未知潜在的功能基因进行注释，应用蛋白组学和转录组学确定功能基因，采用基因敲除、基因随机突变和定位突变等方法，对突变菌株进行筛选，将生防菌株改造成功能明确、强大的工程菌株是正在研究的重要方向之一。另外，改变发酵菌株的营养物质和生长条件，例如C源、N源、微量元素、pH、矿物质、温度、溶氧量、转速等，诱导其在不同条件下产生不同的次级代谢产物，分离纯化代谢产物并对不同的组分进行体外抑菌试验，利用LC-ESI-MS、HPLC-NMR等技术分析鉴定其抗菌物质，以期研究发现更多的天然新型农用抗生素。

参考文献：

[1] MARC O，PHILIPPE J. Bacillus lipopeptides：versatile weapons for plant disease biocontrol[J]. Trends in Microbiology， 2007， 16（3）：115-125.

[2] LEE J P，LEE S W，KIM C S，et al.Evaluation of formulations of Bacillus licheniformis from the biological control of tomato gray mold caused by Botrytis cinerea[J]. Biological Control， 2006，37（3）：329-337.

[3] ROCHA D J A，MOURA A B. Biological control of tomato wilt caused by Ralstonia solanacearum and Fusarium oxysporum f.sp lycopersici by rhizobacteria[J]. Tropical Plant Pathology，2013， 38（5）：423-430.

[4] HSIEH F C，LIN T C，MENG M，et al.Comparing methods for identifying Bacillus strains capable of producing the antifungal lipopeptide iturin A[J]. Current Microbiology，2008，56（1）：1-5.

[5] 周田甜.番茄青枯病拮抗菌J12和J2的分离鉴定及抗生素2， 4-DAPG合成和调控研究[D].南京：南京农业大学，2012.

[6] ARIMA K，KAKINUMA A，TMURA G.Surfactin acrystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis isolation， characterization and its inhibition off fibrin clot formation[J]. Biochemical and Biophysical Research Communication，1968， 31（3）：488-496.

[7] MOYNE A L，SHELBY R， CLEVELAND T E，et al.Bacillomycin D：An iturin with antifungal activity against Aspergillus favus[J].Journal of Applied Microbiology，2001，90（4）：622-629.

[8] GUO Q G，DONG W X，LI S Z，et al.Fengycin produced by Bacillus subtilis NCD-2 plays a major role in biocontrol of cotton seedling damping-off disease[J]. Microbiological Research，2014，169（7-8）：533-540.endprint

[9] 黄 曦，许兰兰，黄荣韶，等.枯草芽抱杆菌在抑制植物病原菌中的研究进展[J].生物技术通报，2010（l）：24-29.

[10] PEYPOUX F，BONMATIN J M，WALLACH J. Recent trends in the biochemistry of surfactin[J]. Appl Microbiol Biotechnol，1999，51（5）：553-563.

[11] DELEU M，BOUFFIOUX O，RAZAFINDRALAMBO H， et al. Interaction of surfactin with membranes： A computational approach[J]. Langmuir，2003，19（8）：3377-3385.

[12] HEERKLOTZ H，WIEPRECHT T，SEELIG J，et al.Membrane perturbation by the lipopeptide surfactin and detergents as studied by Deuterium NMR[J]. J Phys Chem B，2004，108（15）：4909-4915.

[13] BAIS H P，FALL R，VIVANCO J M.Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production[J].Plant Physiology，2004，134（1）：307-319.

[14] MAGET-DANA R，PEYPOUX F.Iturins，a special class of pore-forming lipopeptides：Biological and physicochemical properties[J].Toxicology， 1994，87（1-3）：151-174.

[15] THIMON L，PEYPOUX F，WALLACH J，et al.Effect of the lipopeptide antibiotic， iturin A，on morphology and membrane ultrastructure of yeast cells[J]. FEMS Microbiol Lett，1995， 128（2）：101-106.

[16] DELEU M，PAQUOT M，NYLANDER T.Fengycin interaction with lipid monolayers at the air-aqueous interface-implications for the effect of fengycin on biological membranes[J].Journal of Colloid and Interface Science，2005，283（2）：358-365.

[17] OKUBARA P A，DICKMAN M B，BLECHL A E.Molecular and genetic aspects of controlling the soilborne necrotrophic pathogens Rhizoctonia and Pythium[J]. Plant Science，2014， 228：61-70.

[18] JOSHI R，GARDENER B B M.Identification and characterization of novel genetic markers associated with biological control activities in Bacillus subtilis[J]. Biological Control，2006，96（2）：144-154.

[19] 曹 云.SQR 9微生物有机肥防治黄瓜土传枯萎病的效应与机制研究[D].南京：南京农业大学，2011.

[20] CAO Y，XU Z H，LING N， et al. Isolation and identification of lipopeptides produced by B. subtilis SQR 9 for suppressing Fusarium wilt of cucumber[J]. Scientia Horticulturae，2012， 135：32-39.

[21] YE Y F，LI Q Q，FU G，et al.Identification of antifungal substance （Iturin A2） produced by Bacillus subtilis B47 and its effect on Southern Corn Leaf Blight[J]. Journal of Integrative Agriculture，2012，11（1）：90-99.

[22] 商伟伟，蔡 良，罗 磊，等.核磁共振技术在枯草芽孢杆菌的抗菌物质结构鉴定中的应用[J].台湾农业探索，2012（1）：67-70.

[23] 龚庆伟.芽孢杆菌抗菌脂肽的分离纯化及Bacillomycin D抑制黄曲霉作用的研究[D].南京：南京农业大学，2012.

[24] CHEN X H，KOUMOUTSI A，SCHOLZ R， et al. Genome analysis of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 reveals its potential for biocontrol of plant pathogens[J].Journal of Biotechnology，2009，140（1-2）：27-37.endprint

[25] LEE Y K，YOON B D，YOON J H，et al.Cloning of srfA operon from Bacillus subtilis C9 and its expression in E.coli[J]. Appl Microbiol Biotechnol，2007，75（3）：567-572.

[26] OHNO A，AAO T，SHODA M.Effect of temperature on production of lipopeptide antibiotics，iturin A and surfactin by a dual producer， Bacillus subtilis RB14，in solid-state fermentation[J].Journal of Fermentation and Bioengineering，1995，80（5）：517-519.

[27] 张 艳.生防菌株Men-myco-93-63发酵工艺优化研究[D]. 河北保定：河北农业大学，2006.

[28] KOUMOUTSI A，CHEN X H，HERINE A，et al.Structural and functional characterization of gene clusters directing nonribosomal synthesis of bioactive cyclic lipopeptides in Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42[J]. Joumal of Bacteriology，2004， 186（4）：1084-1096.

[29] YANG C K，TAI P C，LU C D.Time-related transcriptome analysis of B. subtilis 168 during growth with glucose[J]. Current Microbiology，2014，68（1）：12-20.

[30] HE S，WANG H Q，WU B，et al.Response surface methodology optimization of fermentation conditions for rapid and efficient accumulation of macrolactin a by marine Bacillus amyloliquefaciens EBS-2[J]. Molecules，2012，18（1）：408-417.

[31] ZHU Z，ZHANG F G，WEI Z，et al.The usage of rice straw as a major substrate for the production of surfactin by Bacillus amyloliquefaciens XZ-173 in solid-state fermentation[J]. Journal of Environmental Management，2013，127：96-102.

[32] BUESCHER J M，LIEBERMEISTER W，JULES M，et al.Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism[J].Science，2012，335（6072）：1099-1103.

[33] CORDERO O X，WILDSCHUTTE H， KIRKUP B，et al.Ecological populations of bacteria act as socially cohesive units of antibiotic production and resistance[J]. Science，2012，337（6099）：1228-1231.

[34] SZCZECH M，SHODA M.The effect of mode of application of Bacillus subtilis rb14-c on its efficacy as a biocontrol agent against Rhizoctonia solani[J]. Journal of Phytopathology，2006， 154（6）：370-377.

[35] CHALANCON G，KRUSE K，BABU M M.Cell biology. Reconfiguring regulation[J].Science， 2012，335（6072）：1050-1051.

[36] JIND■ICHOV B，BURKETOV L，NOVOTN Z. Novel properties of antimicrobial peptide anoplin[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2014，444（4）：520-524.

[37] CAPORASO G J，LAUBER C L，WALTERS W A，et al.Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms[J].The ISME Journal，2012，6（8）：1621-1624.endprint