Y 染色体AZFc区完全缺失患者ICSI治疗妊娠结局分析

李明昭，赵小利，任文娟，师娟子

（西北妇女儿童医院生殖中心，西安 710003）

不育影响着大约10%～15%的育龄夫妇，其中由男性因素导致者约占50%，而男性因素中Y 染色体微缺失是一个重要的致病因素［1］。Y 染色体微缺失被认为是男性特发性不育最重要的遗传学病因，这种微小缺失可以造成不同程度的生精障碍，如无精子症和严重少精子症等［2］。国内外报道的Y 染色体微缺失主要发生于AZFc区，约占各类缺失的60%［3］。AZFc区缺失者表型多样，从轻度少精子症到无精子症等，约2／3的患者表现为无精子症，其中约50%的患者经睾丸穿刺可获得精子，余下1／3的患者多表现为少精子症。因此，理论上AZFc区缺失可以通过卵胞浆内单精子注射（ICSI）技术获得自己的后代。但是关于Y 染色体AZFc区缺失是否影响患者ICSI助孕治疗的妊娠结局，目前报道较少，且研究结果存在争议［4］。本研究对我中心确诊的AZFc区完全缺失患者的精子获得率进行统计，分析其中行ICSI鲜胚移植的患者（研究组）和同期行ICSI治疗、无AZFc区缺失的无精子症和严重少精子症患者（对照组）的临床资料，比较两组患者的妊娠结局。

一、资料与方法

1.研究对象：收集2013年6月至2014年8月在我中心确诊的79例Y 染色体AZFc区完全缺失的患者资料。其中行ICSI治疗鲜胚移植的27例患者为研究组，均为严重少精子或无精子症患者；另外，选择同期在我中心行ICSI治疗、无Y 染色体微缺失的严重少精子症和无精子症患者58例为对照组。我中心诊断为严重少精子症或无精子症的患者均行Y 染色体微缺失检测。

研究组患者年龄25～42 岁，对照组患者年龄27～46 岁，均为婚后夫妻生活正常、未采取避孕措施1年以上未育者。排除梗阻性无精子症及合并其他全身性疾病或严重感染的患者。女方不育因素主要包括：输卵管因素、子宫内膜异位症、盆腔粘连等。

2.诊疗回顾：（1）取精：AZFc区完全缺失患者获取精液的方式包括手淫射精、睾丸穿刺和显微手术取精。一般AZFc区完全缺失患者进行不育治疗前先通过手淫方式留取新鲜精液，行精液常规检测，确认精液质量是否符合ICSI标准［精液常规处理后前向运动精子总数低于（0.3～2）×106／ml］。如取卵当日男方精液处理后符合ICSI标准，则行ICSI治疗；如精液标本不符合ICSI标准，则行睾丸穿刺取精进一步确定是否符合ICSI标准；部分睾丸穿刺后仍不符合ICSI标准的患者，遵循患者意愿尝试显微手术取精。本研究中研究组27例患者和对照组58例患者的精液均来自手淫射精。（2）精液分析：按照世界卫生组织（WHO）精液评估标准，连续3次精液分析并经离心沉淀均无精子者视为无精子症，精子浓度＜5×106／ml者视为严重少精子症［5］。（3）AZF检测：使用深圳亚能生物技术有限公司提供的Y 染色体微缺失检测试剂盒，通过多重聚合酶链反应（PCR）扩增，检测Y 染色体AZFc区SY254、SY255、SY242、SY239 的表达情况，内控对照为雄性性别决定基因（SRY），每次检测均以已育健康男性基因组DNA 作为阳性对照。PCR 反应体系及操作步骤参照试剂盒说明书进行，反应条件：95℃预变性6min，95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸7min。PCR 扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，100 V 电压下电泳90min，使用凝胶成像系统（上海天能）观察并照相，分析条带结果。SY254、SY255、SY242、SY239表达均为阳性，则判定为AZFc区完全缺失。（3）控制性促排卵（COH）：所有患者的女性配偶从黄体中期开始给予短效曲普瑞林（博福-益普生，法国）降调节，0.1mg／d，14d后，测定血清雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）及黄体生成素（LH）水平，当达到降调标准（FSH＜5 U／L，LH＜5 U／L，E2＜110pmol／L）后，使用促性腺激素（Gn）促排卵，当3个以上卵泡直径≥18mm 时，注射人绒毛膜促性腺激素（HCG，珠海丽珠）5 000～10 000U 诱导排卵，注射后36h左右取卵。（4）ICSI：精液处理采用密度梯度离心法，卵母细胞经培养液充分洗涤后置受精液G-IVF（Vitrolife，瑞典）中预培养3h，用透明质酸酶消化颗粒细胞，将去除颗粒细胞的卵母细胞置G-IVF 培养液中预培养0.5h。在400倍放大倍数下挑选形态相对正常的精子，常规精子制动后行ICSI。（5）胚胎移植及妊娠判断：按照Peter卵裂期胚胎评分系统评估第3天（D3）胚胎质量，Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级胚胎视为可用胚胎，Ⅰ级和Ⅱ级胚胎视为优质胚胎［6-7］。胚胎移植后2 周尿HCG 检测阳性者为生化妊娠，移植后5周B 超检查可见孕囊及胎心搏动者为临床妊娠。

3.统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，计量资料采用（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以%表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为有统计学差异。

二、结果

1.Y 染色体AZFc区完全缺失患者的精子获得情况：79例AZFc区完全缺失患者中，38例患者取到精子，精子获得率为48.10%，其中手淫射精33例，占86.84%；睾丸穿刺2 例，占5.27%；显微手术取精3例，占7.89%。

2.两组患者一般情况比较：两组患者平均年龄、女性配偶年龄、不育年限、精液浓度、基础FSH值、基础E2值、促排卵周期获卵数、注射MⅡ卵数、移植日子宫内膜厚度、移植胚胎数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

3.两组妊娠结局比较：两组受精率（65.05%vs.70.07%）、卵裂率（97.34%vs.96.02%）、优胚率（44.81% vs.40.88%）、可 用 胚 胎 率（79.23%vs.78.45%）、种植率（39.13%vs.43.27%）、临床妊娠率（51.85%vs.58.62%）、流产率（7.14%vs.5.88%）及异位妊娠率（0%vs.2.94%）比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表1 两组患者一般情况比较（±s）

表1 两组患者一般情况比较（±s）

组 别 周期数 男方年龄（岁） 女方年龄（岁） 不育年限（年） 精液浓度（106／ml） 基础FSH（U／L）研究组 27 31.26±4.02 28.77±3.55 3.74±2.52 3.81±1.45 6.44±1.65对照组 58 30.81±3.76 28.12±3.81 3.66±2.68 4.66±2.31 6.75±1.83组 别 周期数 基础E2（pmol／L） 获卵数（个） 注射MⅡ卵数（个） 内膜厚度（mm） 移植胚胎数（枚）研究组 27 145.74±68.17 13.22±4.52 10.56±5.78 11.28±2.41 1.81±0.42对照组 58 137.98±63.14 12.41±4.92 9.62±4.39 11.71±2.08 1.83±0.50

表2 两组患者妊娠结局比较［n（%）］

三、讨论

近年来，众多研究表明男性不育的遗传学病因主要包括基因突变、染色体畸变、单核苷酸多态性及Y 染色体微缺失，其中Y 染色体微缺失较为常见［8］，有研究表明中国男性不育患者中Y 染色体缺失率约为10.8%，其中无精子症和严重少精子症患者中缺失率分别为11.75%和8.51%［3］。Y 染色体长臂的AZF区是微缺失的高发区域，该区域的基因微缺失可引起不同程度的精子发生障碍，继而导致男性不育。AZF区域存在4个亚区，分别为AZFa、AZFb、AZFc和AZFd，不同区域的缺失所导致的临床表现也各不相同：AZFa区微缺失，临床表现一般为无精子症，伴随睾丸体积稍小；AZFb区微缺失，生精过程阻滞在精母细胞阶段，亦无精子生成；AZFc区微缺失，表现为偶见少量的活动精子，其中精子畸形数量明显增多；AZFd区微缺失，表现为轻度少精子症或精子数量正常，但形态异常［9-10］。

国内外研究报道的Y 染色体微缺失主要发生在AZFc区，约占总缺失的60%［11］。我们先前的研究对616名无精子症和重度少精子症患者进行Y染色体微缺失检测，其中AZFc 区缺失率为60.9%［12］，和 文 献［11］报 道 基 本 一 致。随 着 精 子 获取技术和ICSI技术的发展，一部分AZFc区完全缺失的患者可以获得精子并通过ICSI技术使女性配偶受孕成功，Choi等［13］在研究中对21 名AZFc区完全缺失的无精子症患者进行睾丸穿刺，其中8名患者获得了满足ICSI操作质量标准的精子，精子获得率为38%。本研究中我们对79名AZFc区完全缺失的患者进行取精，其中38名患者获得精子，获得率（48.1%）高于Choi等的研究，且大部分患者是手淫射精，这可能与该79名患者中无精子症患者所占比率较少有关系，该79例患者大部分为严重少精子症。Liu等［4］比较了AZFc区完全缺失和无Y 染色体缺失患者的ICSI结局，发现AZFc区完全缺失会降低受精率，但不影响妊娠率。吴畏等［14］选取Y染色体微缺失的患者48例56个周期和同期治疗的未发现Y 染色体微缺失的严重少弱精子或无精子症患者90 例94个周期，两组妊娠率分别为37.5%和35.1%，差异并无统计学意义。

本研究比较了AZFc区完全缺失患者和无Y染色体微缺失的无精子症和严重少精子症患者的受精率、卵裂率、优胚率、可用胚胎率、种植率、临床妊娠率、流产率及异位妊娠率等，结果表明两组间差异均无统计学意义，提示Y 染色体AZFc区完全缺失可能并不影响ICSI的妊娠结局。已有研究表明AZFc区缺失会遗传给男性后代，但女性后代不孕的风险通常不会增加，患者可以选择进行种植前遗传学诊断（PGD），选择女胚进行移植［15］。由于Y 染色体AZFc区完全缺失行ICSI治疗的病例资料仍然有限，分析结果可能存在一定的片面性，因此之后的研究应进一步积累资料，扩大样本量进行深入探讨。

［1］ Babu SR，Swarna M，Padmavathi P，et al.PCR analysis of Yq microdeletions in infertile males，a study from South India［J］.Asian J Androl，2002，4：265-268.

［2］ 李座祥，汪朝晖，王媛媛，等.无精子症和严重少精子症患者Y 染色体微缺失和基因缺失研究［J］.生殖医学杂志，2006，15：217-221.

［3］ Fu L，Xiong DK，Ding XP，et al.Genetic screening for chromosomal abnormalities and Y chromosome microdeletions in Chinese infertile men［J］.J Assist Reprod Genet，2012，29：521-527.

［4］ Liu XH，Qiao J，Li R，et al.Y chromosome AZFc microdeletion may not affect the outcomes of ICSI for infertile males with fresh ejaculated sperm［J］.J Assist Reprod Genet，2013，30：813-819.

［5］ 世界卫生组织.世界卫生组织男性不育标准化检查与诊疗手册［M］.北京：人民卫生出版社，2007：131-133.

［6］ Brinsden PR.A textbook of in vitro fertilization and assisted reproduction［M］.New York：The Parthenon Publishing Group，1999：1996.

［7］ Gardner DK，Lane M，Stevens J，et al.Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome：towards a single blastocyst transfer［J］.Fertil Steril，2000，73：1155-1158.

［8］ Asero P，Calogero AE，Condorelli RA，et al.Relevance of genetic investigation in male infertility［J］.J Endocrinol Invest，2014，37：415-427.

［9］ 李座祥，王琳，唐文豪，等.Y 染色体无精子症因子区及男性不育相关基因研究进展［J］.生殖医学杂志，2005，14：176-181.

［10］ 丛学文，涂向东，严爱贞，等.精子生成障碍患者Y 染色体AZFc区部分缺失分析［J］.中华男科学杂 志，2010，16：594-598.

［11］ Wang RX，Fu C，Yang YP，et al.Male infertility in China：laboratory finding for AZF microdeletions and chromosomal abnormalities in infertile men from Northeastern China［J］.J Assist Reprod Genet，2010，27：391-396.

［12］ 李明昭，施文浩，李伟，等.无精子症和重度少精子症不育患者Y 染色体微缺失率的临床研究［J］.生殖医学杂志，2015，24：125-128.

［13］ Choi DK，Gong IH，Hwang JH，et al.Detection of Y chromosome microdeletion is valuable in the treatment of patients with nonobstructive azoospermia and oligoasthenoteratozoospermia：sperm retrieval rate and birth rate［J］.Korean J Urol，2013，54：111-116.

［14］ 吴畏，周作民，林敏，等.Y 染色体微缺失患者与无精子或严重少弱精子症患者ICSI治疗结局比较［J］.中华男科学杂志，2011，17：771-774.

［15］ Patrat C，Bienvenu T，Janny L，et al.Clinical data and parenthood of 63infertile and Y-microdeleted men［J］.Fertil Steril，2010，93：822-832.