选择性双胚胎移植对IVF-ET 妊娠结局的影响

董胜男，刘炜，王炎秋，周围，石礼红，赵起越，谢晓东，纪亚忠＊

（1.同济大学附属同济医院生殖医学科，上海 200065；2.山东建筑大学附属校医院，济南 250101）

多胚胎移植可提高临床妊娠率，但易致多胎妊娠，影响母婴安全及健康。为减少多胎妊娠，目前国内外部分生殖医学中心已调整为移植2枚［1］、甚至1枚［2］胚胎。另有临床数据表明，胚胎质量与临床妊娠率存在相关性，但不同胚胎质量对活产率的影响仍有争议［3］。本文回顾了我中心第3天、二枚胚胎移植的相关数据，按照胚胎的形态学分级，分别对各组间患者年龄、不育年限、不育因素以及临床妊娠率、抱婴率、活产率等临床结局进行了统计学比较。现将结果报告如下。

资料与方法

一、研究对象与分组

选取2012年6月至2014年5月在上海市同济医院生殖中心行两枚第3天胚胎移植的所有夫妇。入选的标准如下：（1）夫妻双方染色体正常且有IVF／ICSI指征的患者；（2）女方年龄不超过35岁；（3）移植2枚第3天胚胎且移植胚胎质量为Ⅰ～Ⅲ级；（4）移植当天内膜厚度为7mm 及以上；（5）促排卵药物为尿促卵泡素（丽申宝，珠海丽珠），根据患者情况，选用长方案、短方案及微刺激方案。考虑丽申宝含有少量LH，促排卵中不加用人绝经期促性腺素（HMG）。排除标准：包含受卵、自然周期取卵、卵母细胞冻融、囊胚移植的周期。将所有周期按照移植胚胎的组合不同分为3组：A 组为移植两枚Ⅰ级胚胎；B组为移植一枚Ⅰ级胚胎和一枚低级别的胚胎；C组为移植两枚非I级胚胎。

二、研究方法

1.取卵及卵细胞的处理：HCG 注射34～36h后在静脉麻醉及B 超引导下经阴道后穹窿穿刺取卵。取卵及卵母细胞传递过程中始终保持37℃。在倒置显微镜下拾卵，迅速将捡到的卵母细胞洗涤后放入平衡液（Irvine Scientific®，美国）［4］中。

2.精液的收集与处理：患者丈夫取精前禁欲3～5d，以手淫法将精液收集在洁净的无菌干燥烧杯中，按WHO 的标准化精液分析法进行常规精液分析，并留取精卡。经密度梯度离心并洗涤两次后置CO2培养箱获能3～6h。

3.授精：取卵后4～6h后，行IVF 的患者，直接将精子加入含有卵母细胞的授精液（Irvine Scientific®，美国）。行ICSI的患者，首先将卵母细胞在透明质酸酶中去除大部分颗粒细胞，然后转移至体外操作液中将透明带以外的全部颗粒细胞去除。在显微注射台上挑选单个优质的精子，制动并注射入MⅡ的卵内。

4.观察原核：于授精后16～18h 用适当口径的拆卵针将IVF的卵母细胞除去颗粒细胞，在显微镜下检查受精情况。正常受精的标准：见到2个独立的或有碎片的极体，同时又有2个清晰的原核。

5.胚胎质量评估和胚胎移植：授精后48h 检查卵裂情况和胚胎分级。胚胎分级是根据卵裂球的数目、有无核碎片及其占整个胚胎的比例以及卵裂球大小是否均匀进行划分的［5-7］，将胚胎质量分为Ⅰ～Ⅳ等级。Ⅰ级为≥7细胞，卵裂球均匀，无碎片或碎片小于整个胚胎的5%；Ⅱ级为≥7细胞，卵裂球大小均匀或稍不均匀，卵裂球碎片6%～15%；Ⅲ级为6细胞，碎片＜30%；Ⅳ级≥6细胞，碎片大于30%或≤5细胞；Ⅴ级2PN，未分裂的胚胎或碎片＞50%的胚胎。所有可移植胚胎不仅在形态学评分上满足Ⅰ～Ⅲ级要求，且必须为2PN、连续生长的胚胎。

6.移植后黄体期支持和妊娠检查：移植后常规使用黄体支持，从移植当天开始持续至移植后72d或妊娠终止时。移植后14d查血β-HCG，阳性者2周后B超检查胎囊、胎心情况。若没有见胎心搏动则一周后复查直至可见胎心搏动或妊娠终止。生化妊娠是指血HCG 升高但未成功形成孕囊的周期，宫内妊娠为血β-HCG 升高且B 超检查见宫内有妊娠囊，各临床结局的计算见表2［8-10］。异位妊娠除非B 超下确认孕囊个数，否则单侧异位妊娠按1个孕囊种植计算。双胎妊娠为异卵双胎妊娠，单卵双胎不纳入计算。

三、统计学分析

采用SPSS 20 统计软件。3 组间计量资料用One-way ANOVA 分析以及t检验，计数资料行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、3组一般情况比较

共442对夫妇，517个周期纳入研究。A 组包含304个周期，女方平均年龄为（29.04±3.62）岁，平均不育年限为（3.90±2.44）年；B 组包含128个周期，女方平均年龄为（28.46±3.55），平均不育年限为（3.70±2.22）年；C 组包含85个周期，女方平均年龄为（29.47±3.96）岁，平均不育年限为（3.93±2.55）年。三组间年龄及不育年限的差异不显著（P＞0.05）。分别将3组的不育因素按照不育原因分为男方因素、输卵管因素、多囊卵巢、卵巢储备功能下降、子宫内膜异位症和不明原因几个亚类。经比较，各组间不育因素构成比差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

二、妊娠结局

1.胚胎种植和胚胎活产情况：随着胚胎组合形态学评级的下降，3组的临床妊娠率、胚胎种植率和抱婴率依次降低，A 组的临床妊娠率、胚胎种植率和抱婴率显著高于B、C两组（P＜0.05），B组的临床妊娠率、胚胎种植率和抱婴率均显著高于C 组（P＜0.05）。A组的胚胎活产率分别高于B组和C组（P＜0.05），B、C组间差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

2.胚胎种植失败和流产情况：3组间的生化妊娠率分别为6.7%、10.1%、15.9%；异位妊娠率分别为1.8%、1.3%、2.8%；早 期 流 产 率 为7.7%、11.4%、8.3%；晚期流产率为6.4%、5.1%、5.6%；3组间的异位妊娠率、早期流产率和晚期流产率两两之间比较无统计学差异（P＞0.05）；C 组的生化妊娠率显著高于A 组和B组（P＜0.05），A、B 组间差异不显著（P＞0.05）（表2）。

表1 3组基线资料比较［（±s），n（%）］

表1 3组基线资料比较［（±s），n（%）］

组 别 例数 女方年龄（岁）不育年限（年）不育原因男方因素 输卵管因素 多囊卵巢综合征卵巢储备功能下降子宫内膜异位症不明原因不孕A 组 304 29.04±3.62 3.90±2.44 57（18.8） 215（70.7） 5（1.6） 18（5.9） 7（2.3） 2（0.7）B组 128 28.46±3.55 3.70±2.22 23（18.0） 86（67.2） 6（4.7） 12（9.4） 1（0.8） 0 C组 85 29.47±3.96 3.93±2.55 13（15.3） 56（65.9） 2（2.4） 11（12.9） 3（3.5） 0

表2 3组妊娠结局比较［%（n）］

3.双胎情况：3 组的双胎种植率分别为31.6%、18.0%、16.5%；双 胎 分 娩 率 为38.6%、21.2%、41.9%。A 组的双胎种植率显著高于其它两组（P＜0.05），B、C 组间双胎种植率相似；C 组的双胎分娩率均显著高于其它两组，A、B 组间并无显著性差异（P＞0.05）（表2）。

三、胎儿性别比例

3组活产胎儿共386名，其中男婴190名，女婴196名。活产胎儿的性别比例总体维持在1∶1.03。各组分别为：A 组73例双胎，116例单胎，男婴124名，女婴138名；B组14例双胎，52例单胎，男婴44名，女婴36名；C 组13例双胎，18例单胎，男婴22名，女婴22名。

讨 论

影响IVF-ET 妊娠结局的因素，除胚胎形态学分级 外［11］，还 涉 及 女 方 年 龄［12］、子 宫 内 膜 的 容 受性、不孕不育因素［13］、促排卵方式［14］以及移植胚胎的数目等。本文选取女方年龄在35 岁以内、移植2枚第3天胚胎的周期，所有周期使用的促排卵药物均为丽申宝，移植当天子宫内膜厚度均在7 mm以上，三组在不育因素构成比上无显著性差异，且移植后黄体支持方法相同，所以本次研究的结果具有较好的可比性。

以往，为了提高妊娠率，人们往往移植多个胚胎。但是多个胚胎移植会增加多胎妊娠的危险，增加高危妊娠发病率，危害母儿健康。因此必须采用一种较为可靠的方法鉴别胚胎质量，以便在移植少量胚胎的情况下可获得更高的妊娠率。本研究显示，随着Ⅰ级胚胎数目下降，临床妊娠率和胚胎种植率呈逐级递减的关系。胚胎形态学评级可以一定程度上反映胚胎的发育潜能，胚胎形态学分级越高，其临床妊娠率和种植率会越高。此外，形态学评分较低胚胎的生化妊娠率远高于两枚Ⅰ级胚胎的组别，提示低级别的胚胎往往会有更高着床失败的比率。但由于本研究中非双Ⅰ级胚胎的移植周期较少，特别是不含Ⅰ级胚胎的组别样本量较小，这一结论尚有待于进一步验证。另外，本研究显示一旦胚胎成功种植形成孕囊后，胚胎形态学评分级对临床妊娠结局并不产生影响，具体表现在各组的异位妊娠率、早期流产率、晚期流产率和活产率均相似，无显著性差异。提示在胚胎种植形成孕囊后，不同评级的胚胎有相似比例的自然淘汰，且与自然流产率相近［15］。这可能与本研究纳入的患者均为35岁以下有关。年龄是影响胚胎质量的重要因素，高龄妇女的卵质量和胚胎质量往往较年轻妇女差［16］，其流产率和胎儿畸形率也较年轻妇女高。因此，这一结论有待于在不同的年龄分组中进行验证。

目前评价胚胎的发育潜能主要为形态学上的鉴别，然而并不是所有形态理想的胚胎均能顺利发育，形态欠佳的胚胎也可以孕育出健康的子代。有报道显示，胚胎的早期分裂阶段发育最初是由母源性的转录与贮存的信息来控制的，而并不是由真正的胚胎基因组控制［17］。因此，早期胚胎的形态学分级并不能完全地反映胚胎的发育潜能。此外，胚胎的形态学分级主要依靠显微镜下的肉眼观察，故主观性较强。因此，我们需要更精准的胚胎评价体系来预测胚胎的发育潜能。目前正在研究其他一些评估胚胎质量的无创检测方法有形态动态观察［18］，胚胎代谢组学指标的检测，包括丙酮酸、氨基酸、葡萄糖的代谢、近红外光谱评价胚胎代谢活动力；胚胎内源性因子的检测，如可溶性人淋巴细胞抗原-G（sHLA-G）的检测。有报道显示胚胎外观评分联合以上某个指标可提高临床妊娠率，如sHLA-G［19］和红外线代谢测量等［20］。此外，还有一些有创的胚胎评价方法，如单细胞基因检测，可以剔除染色体异常的胚胎［21］。目前代谢物分析方法和技术平台尚未完全建立，尚处于起步阶段；单细胞基因检测费用高、技术难度大，目前还不能普遍推广。但这些新兴的技术均具有极大的发展潜力，随着胚胎评价技术的发展，必定能制定出一套适合于第3天胚胎的且能高度预测胚胎存活的体系标准，以提高妊娠结局。

本文病例中，35岁以下年轻妇女的双胎活产比例为35%。当移植两枚Ⅰ级胚胎时，双胎率可达38.6%。结合本文的胚胎种植率和胚胎活产率，若仅移植一枚Ⅰ级第3天胚胎，35岁以内女性的临床妊娠率及活产率分别可达52.0%、43%左右。临床妊娠率虽有降低，仍在可接受范围内，但可杜绝异卵双胎的产生以及由此带来的母婴潜在的风险。

［1］ Sazonova A，Källen K，Thurin-Kjellberg A，et al.Obstetric outcome after in vitro fertilization with single or double embryo transfer［J］.Hum Reprod，2011，26：442-450.

［2］ Grady R，Alavi N，Vale R，et al.Elective single embryo transfer and perinatal outcomes：a systematic review and meta-analysis［J］.Fertilit Steril，2012，97：324-331.

［3］ 陈欣洁，孙筱放，黄艳仪，等.胚胎质量对体外受精妊娠结局的影响［J］.生殖医学杂志，2001，10：19-23.

［4］ Papanikolaou EG，D’haeseleer E，Verheyen G，et al.Live birth rate is significantly higher after blastocyst transfer than after cleavage-stage embryo transfer when at least four embryos are available on day 3 of embryo culture.A randomized prospective study［J］.Hum Reprod，2005，20：3198-3203.

［5］ Racowsky C，Vernon M，Mayer J，et al.Standardization of grading embryo morphology［J］.Fertil Steril，2010，94：1152-1153.

［6］ Tomás C，Orava M，Tuomivaara L，et al.Low pregnancy rate is achieved in patients treated with intracytoplasmic sperm injection due to previous low or failed fertilization in in-vitro fertilization［J］.Hum Reprod，1998，13：65-70.

［7］ Ziebe S，Petersen K，Lindenberg S，et al.Embryo morphology or cleavage stage：how to select the best embryos for transfer after in-vitro fertilization［J］. Hum Reprod，1997，12：1545-1549.

［8］ 马翔，丁卫，冒韵东，等.授精第3日单胚胎移植与双胚胎移植临床结局分析［J］.生殖与避孕，2011，31：554-561.

［9］ Oron G，Son WY，Buckett W，et al.The association between embryo quality and perinatal outcome of singletons born after single embryo transfers：a pilot study［J］.Hum Reprod，2014，29：1444-1451.

［10］ Zeadna A，Son WY，Moon JH，et al.A comparison of biochemical pregnancy rates between women who underwent IVF and fertile controls who conceived spontaneously［J］.Hum Reprod，2015，30：783-788.

［11］ Zander-Fox DL，Henshaw R，Hamilton H，et al.Does obesity really matter？The impact of BMI on embryo quality and pregnancy outcomes after IVF in women aged≤38years［J］.Aust N Z J Obstet Gynaecol，2012，52：270-276.

［12］ 丁锦丽，杨菁，张艳，等.D3非优质胚胎的冷冻价值及其临床结局分析［J］.生殖医学杂志，2015，24：267-271.

［13］ Benaglia L，Bermejo A，Somigliana E，et al.Pregnancy outcome in women with endometriomas achieving pregnancy through IVF［J］.Hum Reprod，2012，27：1663-1667.

［14］ 王雅琴，杨菁，徐望明，等.35岁以下患者长方案促排卵获卵数对体外受精-胚胎移植结局的影响［J］.生殖医学杂志，2011，20：270-274.

［15］ Regan L，Braude PR，Trembath PL.Influence of past reproductive performance on risk of spontaneous abortion［J］.BMJ，1989，299：541-545.

［16］ Ziebe S，Loft A，Petersen JH，et al.Embryo quality and developmental potential is compromised by age［J］.Acta Obstet Gynecol Scand，2001，80：169-174.

［17］ Braude P，Bolton V，Moore S.Human gene expression first occurs between the four-and eight-cell stages of preimplantation development［J］.Nature，1988，332：459-461.

［18］ Herrero J，Meseguer M.Selection of high potential embryos using time-lapse imaging：the era of morphokinetics［J］.Fertil Steril，2013，99：1030-1034.

［19］ Wen SW，Demissie K，Yang Q，et al.Maternal morbidity and obstetric complications in triplet pregnancies and quadruplet and higher-order multiple pregnancies［J］.Am J Obstet Gynecol，2004，191：254-258.

［20］ Vergouw CG，Kieslinger DC，Kostelijk EH，et al.Day 3 embryo selection by metabolomic profiling of culture medium with near-infrared spectroscopy as an adjunct to morphology：a randomized controlled trial［J］.Hum Reprod，2012，27：2304-2311.

［21］ Yang Z，Liu J，Collins GS，et al.Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients：results from a randomized pilot study［J］.Mol Cytogenet，2012，5：24.