锡林浩特某牧场奶牛乳房炎致病菌分离鉴定

梁 薇

(锡林郭勒职业学院，026000)

本试验主要以锡林浩特某牧场为试验对象，采集50份患有临床型乳房炎奶牛的奶样和50份患有隐性乳房炎奶牛的奶样，进行致病菌的分离、鉴定，生化鉴定和药敏试验。本试验为指导临床合理用药和提高奶牛乳房炎防治效果提供了相关的理论依据，也为系统开展奶牛乳房炎致病菌的分子流行病学调查、血清学分型和耐药性研究奠定了一定的基础。

1 实验材料

1.1培养基

普通的琼脂培养基，SS琼脂培养基，西檬氏枸橼酸盐培养基和营养肉汤，高盐甘露醇琼脂培养基，三糖铁琼脂培养基，血液琼脂培养基，伊红美兰琼脂培养基。

1.2试剂

葡萄球菌属细菌生化鉴定管，链球菌细菌生化编码鉴定管，肠杆菌科细菌生化编码鉴定管；药物敏感纸片。

2 实验方法

2.1样品采集

2015年6月，在锡林浩特某牧场采集100份奶牛乳样，50份为临床型乳房炎奶牛的乳样，50份为隐性乳房炎的乳样，这100份乳样都符合《动物疾病实验室检验手册》的采集标准。对于患有临床型乳房炎的奶牛，可以通过观察奶牛的乳房情况，是否有发热、疼痛和肿胀现象，另外还可以观察患牛的乳汁，看乳汁中是否有絮片或者是凝块和血奶，诊断确认为临床型乳房炎以后采集奶样。对于患有隐性乳房炎的奶牛使用CMT检测法检测奶牛的乳样，经确认为隐性乳房炎以后进行奶样采集。采集乳样的时候，先用碘伏对专业人员进行消毒，然后通过对酒精棉进行相关的脱碘处理，实现对前三把奶的处理，最终实现对无菌操作的进一步实现，在对五六毫升的奶样进行处理的过程中放到了十毫升的无菌试管当中，使得乳头最终能够避免对采样管的解除，最终将奶样放到沐浴球上带回实验室中进行理论分析。

2.2致病菌分离鉴定

2.2.1分离培养

充分摇动采集的奶样，然后用灭菌的生理盐水进行稀释，最后用灭菌的棉签涂在普通琼脂培养基、SS琼脂培养基、血液琼脂培养基、伊红美兰琼脂培养基进行接种。将这些接种有乳样的培养基放在37℃的恒温箱里面培养24h～48h，挑选出比较典型的菌落进行涂片和革兰染色，再做镜检。按照菌落的形态、染色后出现的特征和菌落的溶血状况先判断出细菌属于哪种大类，然后再进一步培养观察。

2.2.2菌种保存

使用斜面保存法对分离的菌种进行保存，针对葡萄球菌和肠道杆菌，直接接种在普通的琼脂斜面上，然后把斜面的底部加一些无糖肉膏液，最后用橡皮塞塞好，经过37℃恒温箱培养24h～48h以后，放在4℃的冰箱里面进行保存，这种保存方法可以将菌种保存3-6个月。针对链球菌应当接种在血液琼脂斜面上，然后放在37℃的恒温箱里面培养24h～48h以后，也放在4℃的冰箱里面进行保存，不过需要注意的是半个月到1个月要移种一次。

2.3生化鉴定

2.3.1葡萄球菌生化鉴定

将在普通琼脂培养基上长的比较好的，革兰氏染色镜检结果为G＋的，以单个或者是葡萄串形状排列的细菌，使用葡萄球菌属细菌生化鉴定管对菌种进行鉴定，每盒10支装，共有11种。鉴定的标准见表1。

表1 不同种葡萄球菌的鉴定标准

2.3.2链球菌生化鉴定

将在血琼脂培养基上长的比较好的，革兰氏染色镜检结果为G＋的，以短链状排列或者是营养肉汤中以长链状排列的细菌，使用链球菌细菌生化编码鉴定管对菌种进行鉴定，每盒10支，共12种。

2.3.3大肠杆菌生化鉴定

将在普通琼脂培养基上长的比较好的，革兰氏染色镜检结果为G-的，以不大不小的短杆菌形状排列的，使用肠杆菌科细菌生化编码鉴定管对菌种进行鉴定，每盒10支，共11种。

2.4药敏试验

药敏试验采用纸片扩散法，检测可以分离得到细菌对药敏纸片的敏感程度。

2.4.1菌液浓度的调节

挑取单个菌落接种到有关的营养肉汤中(链球菌中要加血清)，通过一定的稀释来延长培养的时间调节浓度，将菌液浓度稀释到一定的程度上，然后放在37℃的恒温箱里面培养24h。

2.4.2细菌涂布接种和贴药敏纸片

将培养后的葡萄球菌和大肠杆菌接种到普通的营养琼脂平板上，链球菌接种到血琼脂平板的表面上，然后用灭菌涂布棒把菌液均匀地涂在平板的表面，待表面稍干燥之后，用无菌摄子夹取有关的抗菌纸片，一定距离贴于平板之上，置室温中恒温培养一天。

2.4.3抑菌圈的测量与记录

用游标卡尺测量抑菌圈的直径和药敏纸片的直径，以1998年中国药品生物检定所和卫生部制定的细菌耐药性标准作为判定标准，直径等于0的为不敏感，直径小于20mm的是低度敏感，直径在20mm至28mm之间的为中度敏感，直径大于28mm的为高度敏感。

3 结果

3.1主要致病菌种类和比例

100份奶样主要致病菌分离情况统计见表2。

表2 样品中主要病原菌分离鉴定的结果

通过表2可以看出，在奶牛分泌的乳样中，金黄色葡萄球菌74株，占细菌总数的69.16%；无乳链球菌27株，占25.23%；大肠杆菌6株，占细菌总数的5.61%。通过分析可以发现，在导致奶牛感染乳房炎的主要致病菌中，金黄色葡萄球菌的比例最高，其次是无乳链球菌，大肠杆菌最少。

3.2病原菌的感染情况

本次实验检测的奶样中，病原菌单独感染的概率为48.78%，其中金黄色葡萄球菌的单独感染的概率高达39.02%;病原菌混合感染的概率高达51.22%，分离的大肠杆菌均是和金黄色葡萄球菌或无乳链球菌混合感染。

导致奶牛感染乳房炎的致病菌中，原因主要是单独感染了金黄色葡萄球菌占细菌总数的39.02%，单独感染了无乳链球菌占细菌总数的9.76，总之，48.78%的奶牛是因为单独感染某一种致病菌导致发生乳房炎，51.22%的奶牛是因为混合感染了多种致病菌导致发生乳房炎。由此可以得出结论，一半以上的奶牛感染乳房炎主要是因为混和感染了多种致病菌。

3.3药敏试验结果

主要致病菌的药敏试验结果见表3。

表3 主要病原菌药敏试验结果(表中数据为抑菌圈直径，单位mm)

通过表3可以看出，在本次药敏试验中，感染金黄色葡萄球菌的奶牛对青霉素不敏感，对林可霉素和环丙沙星高度敏感，对先锋霉素V、阿米卡星、庆大霉素和氟呱酸为中度敏感，对菌必治、利福平、链霉素、罗红霉素、红霉素、复方新诺明、克林霉素、痢特灵和四环素低度敏感。感染无乳链球菌的奶牛对青霉素也不敏感，对林可霉素和环丙沙星高度敏感，对先锋霉素V、利福平、阿米卡星和庆大霉素中度敏感，对菌必治、链霉素、罗红霉素、红霉素、复方新诺明、氟呱酸、克林霉素、痢特灵和四环素低度敏感。感染大肠杆菌的奶牛对先锋霉素V、庆大霉素和林可霉素高度敏感，对氟呱酸、四环素和环丙沙星中度敏感。对青霉素、菌必治、利福平、链霉素、阿米卡星、罗红霉素、红霉素、复方新诺明、克林霉素和痢特灵为低度敏感药物。

3.4讨论

引起奶牛感染病原体的原因有很多，包括各种细菌和病毒，这种情况下，实现对病原微生物的研究就十分重要。通过试验研究发现导致奶牛感染乳房炎的主要的致病菌有葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌，其中葡萄球菌和链球菌占致病菌总数的94.39%，大肠杆菌只有5.61%。而且根据调查研究还可以发现：如果奶牛被其中一种细菌感染，其自身的免疫力及抵抗力会下降，就更容易被其他的病菌侵害。由此可见，奶牛极有可能是被其中一种病菌侵害，且发生混合感染的概率更高，高达51.22%。在对感染金黄色葡萄球菌而发生乳房炎的奶牛进行用药治疗时，需要注意药物的敏感性，尤其要注意林可霉素和环丙沙星的用药，这两种属于高度敏感药物；尽量不使用先锋霉素V、阿米卡星、庆大霉素和氟呱酸等中度敏感药物；谨慎使用菌必治、利福平、链霉素、罗红霉素、红霉素、复方新诺明、克林霉素、痢特灵和四环素等低敏感度药物。对感染无乳链球菌而发生乳房炎的奶牛进行用药治疗时，尤其要注意林可霉素和环丙沙星这两种高度敏感药物；尽量不使用先锋霉素V、利福平、阿米卡星和庆大霉素等中度敏感药物；谨慎使用菌必治、链霉素、罗红霉素、红霉素、复方新诺明、氟呱酸、克林霉素、痢特灵和四环素等低度敏感药物。在对感染大肠杆菌而发生乳房炎的奶牛进行用药治疗时，尤其要注意先锋霉素V、庆大霉素和林可霉素等高度敏感药物的使用；尽量不使用氟呱酸、四环素和环丙沙星等中度敏感药物；谨慎使用青霉素、菌必治、利福平、链霉素、阿米卡星、罗红霉素、红霉素、复方新诺明、克林霉素和痢特灵等低度敏感药物。

另外，本实验还有一些不足之处 ，主要表现在通过试验分析只分别得出了金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌的药物敏感情况，没有总结出奶牛混合感染多种致病菌导致发生乳房炎以后，在临床用药时应当注意选择哪些敏感药物，此后还应进行混合感染后敏感药物筛选方面的研究，对临床用药具有重要的指导意义。