燕窝中亚硝酸盐快速检测技术及高灵敏试剂盒的研制

程金生 朱文娟 万维宏

摘要：设计开发了一种亚硝酸盐快速检测试剂盒，并建立一种利用该试剂盒检测燕窝中亚硝酸盐含量的便捷方法。该方法采用大孔树脂富集亚硝酸盐后，再应用改进型格里斯（Griess）比色法对燕窝中的亚硝酸盐含量进行快速准确的测定。通过观察样品的色阶，与标准比色卡比较，判断亚硝酸盐含量。该试剂盒灵敏度、准确度高，快速，简便，价廉，亚硝酸盐最低检测浓度可达0.1 mg/kg，可用于各类燕窝制品及火腿、罐头、腌制品中亚硝酸盐含量的快速检测。

关键词： 试剂盒；快速检测；亚硝酸盐；燕窝

中图分类号：O656.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）13-3250-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.13.047

High Sensitive Analysis Technology and Kit for Rapid Detection of Nitrite

in Edible Bird′s Nest

CHENG Jin-sheng，ZHU Wen-juan，WAN Wei-hong

（Institute of Hakka Health Care， School of Medicine， Jiaying University， Meizhou 514031， Guangdong， China）

Abstract： We designed and developed a rapid detection kit for nitrite content， and established a convenient method for nitrite content by the detection kit in edible bird's nest. After enriching the nitrite by macroporous resin， then using modified Griess method to determine the content of nitrite in edible bird′s nest by colorimetric method. By observed the difference between the color gradation of sample in colorimetric tube and that of the standard colorimetric card， the content of nitrite in edible bird's nest could be determined. The detection kit in this work have high sensitivity， accuracy， rapidness， simplicity and cheapness， the lowest detection of nitrite concentration could take up to 0.1 mg/kg， which can be applied to the content detection of nitrite in various commercial products， for example， bird's nest， ham， canned food， pickled products， etc.

Key words： kit； rapid detection； nitrite； birds nest

亚硝酸盐在中国肉制品加工生产中经常被大量使用[1，2]。由于价格低廉，许多燕窝产品、蔬菜腌制品和瓜子炒货产品都超标使用亚硝酸盐，导致亚硝酸盐超标严重。亚硝酸盐可与食物或胃中的仲胺类物质反应生成亚硝胺，而亚硝胺是国际公认对人体的食管癌、鼻咽癌、胃癌、膀胱癌发病密切相关。此外，该类物质还可通过胎盘可致使胎儿畸形及中毒死亡。亚硝酸盐的人中毒剂量为0.3～0.5 g，致死量为3 g。中国对食品中的亚硝酸盐含量也有明确的限量规定，其中蔬菜为4 mg/kg、酱腌菜为20 mg/kg、肉制品为30 mg/kg，其他食品均小于10 mg/kg，而燕窝的限量规定是30 mg/kg[3，4]。燕窝主要产于中国南海诸岛及东南亚各国，作为传统保健品，燕窝（尤其是血燕）价格高昂，然而，却潜伏着重大安全隐患。如浙江省工商局2011年8月15日召开的新闻发布会宣布，抽检发现燕窝市场中马来西亚产血燕的亚硝酸盐含量严重超标，部分问题血燕产品含量最高达11 000 mg/kg。广东检验检疫局近年来也从一些所谓“血燕”、“黄燕”等染色燕窝中检出高浓度的亚硝酸盐，有的每千克中达到几千毫克。香港科技大学抽查市面47款燕窝样本，发现全部含亚硝酸盐，最严重的一个血燕样本含6 400 mg/kg，较香港肉食中亚硝酸盐含量标准高出31倍[5]，由此可见燕窝行业亚硝酸盐含量超标问题的严重性。

世界各国对亚硝酸盐的使用范围和使用量都有明确的规定。卫生部2012年4月5日发出通知，食用燕窝亚硝酸盐临时管理限量值为30 mg/kg[6]。国际上一般参照燕窝主产国之一马来西亚标准（马来西亚食用燕窝（EBN）标准指南MS 2334：2010），其限量标准也为30 mg/kg。

目前检测燕窝制品中亚硝酸盐含量的方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、离子色谱法（IC）、毛细管电泳法（CE）、分光光度法等。如黄艳梅等[3]成功利用离子色谱阴离子分析柱对燕窝中亚硝酸盐进行分离测定，22 min同时完成8种阴离子的测定，取得较好的效果。李兆奎等[2]应用紫外分光光度法测定燕窝样品中亚硝酸盐的含量，检测波长为538 nm，结果显示，亚硝酸盐的线性范围为0～10.0 μg，平均加样回收率97.7%，RSD为2.0%（n=5）。HPLC法、GC法、IC法及CE法等这些仪器方法检测燕窝制品中亚硝酸盐，优点是检测精确度高，缺点是检测时间长、操作复杂、需配置较贵重仪器，甚至还需配备各种型号的色谱柱，对操作人员、维护条件也有一定要求。而分光光度法同样需要配置专门仪器及具有一定经验的操作人员，因而不容易推广[5-7]。

如今国际上日益重视应用Griess比色法来检测食品中亚硝酸盐含量，样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N-1-萘基乙二胺偶合形成红色染料，即可测得亚硝酸盐含量。如刘岩等[7]开展了香肠类肉制品中亚硝酸盐的快速检测法，对香肠类肉制品中亚硝酸盐含量的定性和半定量分析的结果较为理想。一些机构研制出利用微孔板快速检测多个样品中亚硝酸盐含量的新仪器，具有使用试剂量少、污染小、检出限低、灵敏度较高、操作简单、方便携带等优点，可用于火腿中亚硝酸盐的测定。英国Aquarium公司及美国Gatwick Koi公司等也相继推出了水池水样中亚硝酸盐含量测试试剂盒产品[8-13]。然而，燕窝组成与其他普通食品或水样有显著差异，燕窝中除蛋白质外，还有含氮物质、膳食纤维及矿物质等组分，样品前处理及检测步骤相对特殊，不可能照搬水样、牛奶或火腿中亚硝酸盐检测方法及试剂盒，而且由于燕窝较其他食品价格昂贵得多，因而取样应尽可能少。但目前国际上尚无专门快速检测燕窝中亚硝酸盐含量的试剂盒产品。国内针对燕窝中亚硝酸盐的快速检测方法及试剂盒产品更是空白。而燕窝作为我国的传统保健品，每年需求量很大，其中潜伏的亚硝酸盐危害也很大。因此，研制专门针对燕窝制品中亚硝酸盐含量的快速检测方法具有重要的经济价值和社会意义。

本研究研制出灵敏度高、结构简单、使用方便、价格便宜、携带方便的快速检测试剂盒，应用于各类燕窝制品中亚硝酸盐含量的快速检测。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

试验用水为去离子水， 对氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺等试剂均购自阿拉丁试剂有限公司，其余为分析纯试剂。

1.2 溶液配制

1.2.1 检测液的制备 Griess溶液A（检测液A，对氨基苯磺酸溶液）：称取4 g 对氨基苯磺酸溶于700 mL水和300 mL冰乙酸中，置棕色试剂瓶中混匀室温贮存。Griess溶液B（检测液B，N-1-萘基乙二胺溶液（1 g/L））：称取0.1 g N-1-萘基乙二胺，加100 mL 60%乙酸溶解混匀后，置棕色试剂瓶中。将检测液A与检测液B等体积混合，即可制备得到Griess试剂；检测液C：饱和硫酸钠溶液32 mL和饱和硼砂溶液68 mL混合，置棕色试剂瓶中。

1.2.2 硼砂-氢氧化钠溶液（pH=10）的制备 取14.768 g硼砂溶解于250 mL水中，配置成浓度为0.05 mol/L的硼砂溶液；取2.0 g氢氧化钠，溶解于250 mL水中，配置成浓度为0.2 mol/L的氢氧化钠溶液；将50 mL的0.05 mol/L的硼砂溶液与43 mL的0.2 mol/L的氢氧化钠溶液混合，即可得pH值为10的硼砂-氢氧化钠溶液。

1.2.3 亚硝酸钠标准溶液的制备 准确称取25.0 mg于硅胶干燥器中干燥24 h的亚硝酸钠，加水溶解后移入500 mL容量瓶中，加100 mL硼砂-氢氧化钠溶液（pH=10）缓冲液，加水稀释至刻度，混匀，在4 ℃避光保存。此溶液相当于50 μg/mL亚硝酸钠溶液。

1.2.4 标准比色卡的制备 准确吸取50 μg/mL亚硝酸钠标准溶液0.10、0.25、0.50、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00、11.00、13.00、15.00、17.00、20.00、21.00、23.00、25.00、27.00、30.00 mL分别置于50 mL试管中加水稀释至刻度摇匀；各吸取1 mL上述溶液滴加在卡片（白色试纸）上，并使卡片均匀湿润，再先后滴加0.4%对氨基苯磺酸和0.2% N-1-萘基乙二胺溶液，使其充分反应、呈色。约5 min，卡片呈现深浅不同色阶的紫红色；将此卡片塑封或拍成照片保存，即为标准比色卡。依照其由浅至深的色阶标准比色卡所对应的亚硝酸钠含量依次为0.10、0.25、0.50、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00、11.00、13.00、15.00、17.00、20.00、21.00、23.00、25.00、27.00、30.00 mg/kg；参照此方法，另外制备50.0、100.0、200.0及380.0 mg/kg比色卡。

2 结果与分析

2.1 检测试剂盒的设计

本试剂盒检测原理：亚硝酸盐与对氨基苯磺酸作用，生成不稳定的化合物，随即与α-萘胺作用，生成红色偶氮化合物。根据颜色的深浅与标准比色定量。

本试剂盒是基于国标GB/T 5009.33-2003《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定方法》等标准开发的一种快速检测试剂盒，其开发原理是采用大孔树脂富集亚硝酸盐后，再应用改进型格里斯（Griess）比色法对燕窝中的亚硝酸盐含量进行快速准确的测定。即在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N-1-萘基乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准比色卡比较定量，并且简化前处理，提高检测精度。而比色法原理是在相同条件下，预先配置标准溶液，按照溶液浓度与色阶的对应程度，制成比色卡。取待测样品溶液的有色溶液，将其颜色与比色卡上的色阶进行比较，用目测法即可判断出待测样品溶液的浓度。

如图1所示，所设计的试剂盒组成：（1）盒体：ABS、PVC、PE、PP等材质；（2）检测液A：10 mL；（3）检测液B：10 mL；（4）检测液C：50 mL；（5）吸管：玻璃材质，2 mL，也可以用一次性塑料吸管替代；（6）玻璃样品杯： 25 mL；（7）透明玻璃比色管：透明玻璃材质，10 mL（刻度容量），尺寸为1.2 cm×1.0 cm× 8.5 cm（长×宽×高），柱形，上开口；（8）透明玻璃亚硝酸盐富集柱：透明玻璃材质，15 mL，尺寸为1.2 cm×1.0 cm× 8.5 cm（长×宽×高），圆柱形，下端有砂芯滤层，具体参见图2；（9）大孔树脂：国产D201大孔树脂，或美国Amberlite IRA-900树脂，也可采用德国Lewatit MP-500树脂；（10）海绵托架：海绵材料；（11）标准比色卡：参见图3，检测范围为0.1～380.0 mg/kg。

应用试剂盒检测燕窝中亚硝酸盐含量典型步骤：将样品捣碎研磨，随后称取0.1 g于样品杯中，加入6 mL去离子水倒入样品杯中，加入2 mL检测液C，搅拌均匀，静置15 min，取上清液；取2 mL样品上清提取液至玻璃比色管，紧接着再滴加A检测液和B检测液各3滴，得混合溶液；往已填装2.5 g大孔树脂的透明玻璃亚硝酸盐富集柱中滴入2 mL去离子水，再将步骤2中的混合溶液倒入该玻璃富集柱中，10 min后，对着自然光观察，将反应柱颜色与标准比色卡上的颜色比较，以确定亚硝酸盐浓度。

图2为所设计开发的试剂盒所用透明玻璃亚硝酸盐富集柱直观示意图。该试剂盒富集亚硝酸盐用的大孔树脂可以是国产D201大孔树脂，也可以是Amberlite IRA-900树脂或Lewatit MP-500树脂，每个透明反应柱一般以填充2.0～3.5 g大孔树脂为宜，可活化后循环使用。活化工序为：将已使用过的树脂取出，用水洗至流出清水后，用5%盐酸浸泡4～8 h后，水洗至pH 6，再用2%～4% NaOH浸泡4～8 h，水洗至pH 7～9，待用。砂芯过滤装置采用特硬优质玻璃材料，壁厚均匀，无气泡，玻璃光洁透明，流量快，耐压和密封性能好，尺寸规格符合国际标准，可供高温高压灭菌使用。

2.2 亚硝酸盐含量检测标准比色卡的应用

如图3所示，观察放样品的透明玻璃亚硝酸盐富集柱中的颜色，与标准比色卡比较，如果样品比色管中的颜色与比色卡某一色阶一致，则表明该样品的亚硝酸盐含量与对应该色阶所标示的亚硝酸盐含量一致；如果样品溶液颜色比比色卡上某一色阶深，但比邻近的某一色阶浅，则该燕窝样品亚硝酸含量在这两个色阶对应的亚硝酸盐含量之间。

3 小结与讨论

本研究成功研制出了灵敏度高、结构简单、使用方便、价格便宜、携带方便的快速检测试剂盒，并可应用于各类燕窝制品中亚硝酸盐含量的快速检测。该试剂盒及检测方法具有如下优点：（1）取样少。每次取样仅需0.1 g；（2）检测限低。本试剂盒最低检测浓度为0.1 mg/kg；（3）检测范围宽。所开发试剂盒有效检测范围为0.1～380.0 mg/kg，较文献报道试剂盒更宽；（4）大孔树脂经活化后可循环利用，有效降低试剂盒成本；（5）样品前处理简单，仅需将燕窝样品用检测液C进行处理，静置后取样即可；（6）燕窝样品取样量为0.1 g，尽量准确；取样时，应取燕窝样品中有代表性的部分；对检测超标的样品应重复检测一次再确定；（7）灵敏度高、快速、结构简单、使用方便、价格便宜、携带方便，可应用于各类燕窝制品中亚硝酸盐含量的快速检测，也适用于火腿、罐头、腌制品等食品中亚硝酸盐的检测。

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