国内外口蹄疫非结构蛋白3A BC抗体ELIS A检测方法的比较

王玉玲，张俊哲，王 可，杨春江，谭绪良

（1.天津出入境检验检疫局，天津 塘沽 300461；2.天津滨海新区塘沽动物疫病预防控制中心，天津 塘沽 300456）

口蹄疫（Foot and Mouth Disease）是由小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）口疮病毒属（Aphthovi⁃rus）的一种病毒引起，是口疮病毒属的惟一成员。口蹄疫是哺乳动物的一种高度接触性传染病，典型的临床特征是在动物的蹄、口腔黏膜以及雌性动物乳头上有水疱发生。口蹄疫对易感的偶蹄动物具有严重的潜在经济危害，是世界各个国家主要防范的动物疫病之一，是影响国际贸易的重大疫病之一[1]。世界动物卫生组织将口蹄疫列为世界各国应通报疫病[2]。口蹄疫能侵害多种动物，偶蹄动物最易感。我国农业部将其列为一类动物疫病[3]，并将其列为进境动物一类传染病。在出入境动物检疫中口蹄疫是法检疫病。

由于口蹄疫在临床上表现的症状与其他水疱性疾病，如猪水疱病、水疱性口炎、水疱性疱疹较难区别，一般都需要通过实验室检验，确认动物是否感染口蹄疫病毒。实验室常采用血清学试验进行口蹄疫病毒抗体的检测，血清学试验包括病毒中和试验、固相竞争酶联免疫吸附试验、液相阻断酶联免疫吸附试验和非结构蛋白抗体试验。本文是对非结构蛋白抗体试验中的间接ELI⁃SA检验试剂盒进行比对，同时与阻断ELISA检验方法进行比较，以期获得可应用于进出境动物检疫和动物临床检疫的更有效试剂盒和检测方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA试剂盒（A），由巴西泛美口蹄疫疫病中心提供；口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA试剂盒（B），购自IDEXX公司；牛口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA试剂盒（C），购自兰州兽医研究所；口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体阻断ELISA试剂盒（D），购自PrioCHECK公司；口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体EITB试剂盒，由巴西泛美口蹄疫疫病中心提供；口蹄疫弱阳性血清（CP1），2个批号，由巴西泛美口蹄疫疫病中心提供；口蹄疫阳性血清（CP2），2个批号，由巴西泛美口蹄疫疫病中心提供；水泡性口炎阳性血清，由云南检验检疫局提供；牛白血病阳性血清，购自IDEXX公司；鹿流行性出血热阳性血清，购自VMRD公司；赤羽病阳性血清，购自IDVET公司；牛病毒性腹泻阳性血清，购自IDEXX公司。

1.2 血清样品 口蹄疫阳性牛血清样品共20份，由某单位提供；口蹄疫阴性牛血清样品共85份，采自进境澳大利亚牛、新西兰牛；乌拉圭牛血清45份。

1.3 A试剂盒口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA检测方法 按照试剂盒使用说明书进行检测。用样品稀释液将血清样品、弱阳性对照血清（CP1）、阳对照血清（CP2）、阴性对照血清作1∶20稀释后加入微量反应板。450 nm和620 nm（作为自动背景校正）双波长下读吸光值（OD值）。T/C=（被检样品的OD值-CN的OD平均值）/（CP1的OD平均值-CN的OD平均值），当T/C＜0.8，样品为阴性；当0.8≤T/C＜1，样品为可疑；当T/C≥1，样品为阳性。

1.4 B试剂盒口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA检测方 按照试剂盒使用说明书进行检测。用样品稀释液将血清样品、阳性对照血清、阴性对照血清作1∶100稀释后加入微量反应板。450 nm波长下读OD值。T/C=（被检样品的OD值-阴性对照的OD平均值）/（阳性对照的OD平均值-阴性对照的OD平均值），当T/C＜0.2，样品为阴性；当0.2≤T/C＜0.3，样品为可疑；当T/C≥0.3，样品为阳性。

1.5 C试剂盒口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA检测方法 按照试剂盒使用说明书进行检测。用样品稀释液将血清样品、阳性对照血清、阴性对照血清作1∶21稀释后加入微量反应板。450 nm波长下读OD值。T/C=（被检样品的OD值-阴性对照的OD平均值）/（阳性对照的OD平均值-阴性对照的OD平均值)，当T/C＜0.2，样品为阴性；当0.2≤T/C＜0.3，样品为可疑；当T/C≥0.3，样品为阳性。

1.6 D试剂盒口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体阻断ELISA检测方法 按照试剂盒使用说明书进行检测。用ELISA缓冲液将血清样品、弱阳性对照血清、阳性对照血清、阴性对照血清作1∶5稀释后加入微量反应板。450 nm波长下读OD值。PI=100-（被检样品的OD值/阴性对照的OD平均值）*100，当PI＜50%，样品为阴性；当PI≥50%，样品为阳性。

1.7 口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体EITB检测方法按试剂盒使用说明书进行检测。用饱和缓冲液将血清样品、弱阳性对照血清（CP1）、阳性对照血清（CP2）、阴性对照血清作1∶200稀释。当样品在3ABC、3A、3B、3D（+/-2C）的着色密度等于或高于CP1对照密度时，判定为阳性；当两个或更多非结构蛋白的着色密度低于对照密度时，判定为阴性。

1.8 敏感性试验 采用1.3、1.4、1.5、1.6、1.7的方法，对20份口蹄疫阳性血清样品进行检测；将2个批号的口蹄疫阳性血清（CP2）分别稀释成1∶5、1∶10两个滴度，样品编号为P1、P2、P3、P4，2个批号的口蹄疫阳性血清原液编号为P5、P6，采用1.3、1.4、1.5、1.6、1.7的方法对6份样品进行检测；同时对2个批号的口蹄疫弱阳性血清（CP1）进行检测，样品编号为P7、P8。

1.9 特异性试验 采用1.3、1.4、1.5、1.6、1.7的方法，对85份口蹄疫阴性血清样品检测；同时对水疱性口炎阳性血清、牛白血病阳性血清、鹿流行性出血热阳性血清、赤羽病阳性血清、牛病毒性腹泻阳性血清共5份样品进行检测，样品编号为N1、N2、N3、N4、N5。

1.10 临床应用试验 采用1.3、1.4、1.5、1.6、1.7的方法，对45份乌拉圭牛血清样品进行检测。

2 结果

2.1 敏感性试验检测结果

2.1.1 EITB的检测结果 20份阳性样品检测均为 EITB 阳性，P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8均为EITB阳性，见表1，并以EITB的检测结果为标准结果，来评估3种检测方法。

2.1.2 A试剂盒口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA检测结果 20份阳性样品中，检测出20份为阳性反应，敏感性为100%（20/20）。P1、P2、P3、P4为阴性，P5、P6、P7、P8为阳性，见表1。

2.1.3 B试剂盒口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA检测结果 20份阳性样品中，检测出18份为阳性反应，2份可疑反应，将可疑反应视为阳性结果，则敏感性为 100%（20/20）。P1、P2、P3、P4为阴性，P5、P6、P7、P8为阳性，见表1。

2.1.4 C试剂盒口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA检测结果 20份阳性样品中，检测出20份为阳性反应，敏感性为100%（20/20）。P2、P4为阴性，P1、P3、P5、P6、P7、P8为阳性反应，见表1。

2.1.5 D试剂盒口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体阻断ELISA检测结果 20份阳性样品中，检测出20份为阳性反应，敏感性为100%（20/20）。P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8均为阳性反应，见表1。

表1 敏感性试验检测结果

2.2 特异性试验检测结果

2.2.1 EITB的检测结果 85份阴性样品检测均为EITB阴性，N1、N2、N3、N4、N5均为EITB阴性，（见表2），并以EITB的检测结果为标准结果，来评估四种检测方法。

2.2.2 A试剂盒口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA检测结果 85份阴性样品中，检测出81份为阴性反应，4份为阳性或可疑反应，特异性为95%（81/85）。N1、N2、N3、N4、N5均为阴性反应（见表2）。

表2 特异性试验检测结果

2.2.3 B试剂盒口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA检测结果 85份阴性样品中，检测出85份为阴性反应，特异性为100%（150/150）。N1、N2、N3、N4、N5均为阴性反应（见表2）。

2.2.4 C试剂盒口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA检测结果 85份阴性样品中，检测出62份为阴性反应，23份为阳性或可疑反应，特异性为73%（62/85）。N1、N2、N3、N4、N5均为阴性反应（见表2）。

2.2.5 D试剂盒口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体阻断ELISA检测结果 85份阴性样品中，检测出84份为阴性反应，1份为阳性反应，特异性为99%（84/85）。N1、N2、N3、N4、N5均为阴性反应（见表2）。

2.3 临床应用试验检测结果

2.3.1 EITB的检测结果 45份乌拉圭牛血清样品检测均为EITB阴性（见表3），并以EITB的检测结果为标准结果，来评估4种检测方法。

2.3.2 A试剂盒口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA检测结果 45份乌拉圭牛血清样品中，检测出39份为阴性反应，6份为阳性或可疑反应，符合率为87%（39/45）（见表3）。

2.3.3 B试剂盒口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA检测结果 45份阴性样品中，检测出41份为阴性反应，4份为阳性或可疑反应，符合率91%（41/45）（见表3）。

2.3.4 C试剂盒口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA检测结果 45份阴性样品中，检测出27份为阴性反应，18份为阳性或可疑反应，符合率60%（27/45）（见表3）。

2.3.5 D试剂盒口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体阻断ELISA检测结果 45份阴性样品中，检测出41份为阴性反应，4份为阳性或可疑反应，符合率91%（41/45）（见表3）。

表3 临床应用试验检测结果

3 讨论

3.1 从敏感性试验检测结果看，20份阳性样品中，采用A、B、C、D检测方法都检测为阳性或可疑，敏感性都达到了100%。但从2个批号的口蹄疫阳性血清的稀释样品检测结果看，D的敏感性最高，1∶10稀释的阳性血清样品仍可检测出阳性结果；C为次之，可检测出1∶5稀释的阳性血清样品；A和B最低，只可检测出阳性血清原液样品；4种检测方法均可检测出弱阳性血清样品；B、C、D的敏感性都不低于A。

3.2 从特异性试验检测结果看，B的特异性为100%，D为99%，A为 95%，C为73%，B和D的特异性都高于A，C则低于A。对于5份其他牛疫病的阳性血清均检测为阴性，说明4种检测方法与该5种疫病无交叉反应。

3.3 从临床应用试验检测结果看，B和D与EITB的检测结果符合性最高，为91%；A的符合性次之，为87%；C的符合性最低，为60%。4种检测方法与EITB的检测结果均不能达到100%符合。依据统计学原理，当试验所用测试样品量比较大时，符合性结果会高于本试验结果。

3.4 酶联免疫电转移吸附试验（EITB）在南美已广泛应用于牛口蹄疫血清学监测，用以评估动物流动风险。目前程序是间接ELISA作3ABC抗体的筛选性试验，如果样品为阳性或可疑结果，再用EITB确定。在大量样品进行血清学调查时，建议结合使用间接ELISA法作为初筛，再用EITB进行确定[1]。此程序也是OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》介绍的口蹄疫非结构蛋白抗体检测程序。本文测试样品的检测结果以EITB为标准检测结果也是基于此程序。

3.5 A盒和EITB试剂盒都是由巴西泛美口蹄疫疫病中心自制的，该中心口蹄疫实验室是OIE参考实验室，目前我国是参照南美的程序对从乌拉圭输入的奶牛进行口蹄疫血清学检测，检测用试剂盒由巴西实验室提供，现从国内还无法购买其生产的试剂盒。为了更好的开展国内口蹄疫检疫和监测工作，尝试寻找到一个检测效果可以与之相符或更好的试剂盒，对实际检测工作尤为必要。

3.6 从本文的比对结果看，B、C、D的敏感性都不低于A，可以说该3种市售的试剂盒作为筛选性试验的检测效果与巴西生产的试剂盒相当。C的敏感性要高于A，是由国内生产的，价格较低，C与A都属于间接ELISA方法，可以替代A进行大量样品的筛选性试验。但由于C的特异性不强，因此还需进行初筛阳性样品的确证试验。从比对结果看，D的敏感性100%、特异性99%、符合性91%，与EITB检测结果相比较，其综合评价是最高的，采用D替代EITB进行血清学确证试验是可行的。当然，从比对结果看，D的敏感性也高于A，可以直接使用D进行口蹄疫血清学检测和监测。

[1]世界动物卫生组织（OIE）.陆生动物诊断试验和疫苗手册[M].5版.北京：农业部兽医局，2004：96.

[2]http://web.oie.int/eng/maladies/en_classification2011.htm.

[3] http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/200812/t20081223_1194404.htm.一、二、三类动物疫病病种名录中华人民共和国农业部公告（第1125号）.