硝普钠及SOD降低大鼠心肌细胞DNA蛋白激酶二聚体和Ku70/80表达

江 文，李 伟，周成斌*

(1.南方医科大学 广东省人民医院 广东省心血管病研究所， 广东 广州 510080;2.四川大学 华西医院 骨科， 四川 成都 610041)



研究论文

硝普钠及SOD降低大鼠心肌细胞DNA蛋白激酶二聚体和Ku70/80表达

江 文1，李 伟2，周成斌1*

(1.南方医科大学 广东省人民医院 广东省心血管病研究所， 广东 广州 510080;2.四川大学 华西医院 骨科， 四川 成都 610041)

目的观察硝普钠(SNP)及自由基清除剂超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)对大鼠心肌细胞H9C2和心肌组织DNA-PKcs和Ku70/80表达的影响。方法体外培养H9C2心肌细胞按SNP浓度和加入的自由基清除剂SOD和CAT浓度分组；SD大鼠随机分为5组，每组8只，分别采用0.9%氯化钠溶液、SNP、SNP+SOD、SNP+CAT和SNP+SOD+CAT行腹腔注射，1周后收集心肌组织。用Western blot法检测各组细胞DNA-PKcs和Ku70/80表达，免疫组织化学法检测DNA-PKcs和Ku70/80表达。结果心肌细胞的DNA-PKcs和Ku70/80蛋白相对表达量均随SNP剂量增加呈递增趋势；加入SOD或CAT或二者合用, 均显著降低DNA-PKcs和Ku70/80表达(P<0.05)。SNP组、SNP+SOD组、SNP+CAT组和SNP+SOD+CAT组大鼠心肌组织DNA-PKcs和Ku70/80表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。结论自由基清除剂SOD和CAT能够通过降低心肌细胞DNA-PKcs和Ku70/80的表达拮抗NO对心肌细胞的损伤。

硝普钠；自由基清除剂；心肌细胞；DNA依赖性蛋白激酶催化亚基；Ku70/80二聚体蛋白

DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(catalytic subunit of the DNA-dependent protein kinase, DNA-PKcs)其与调节亚基Ku70/Ku80二聚体共同启动细胞非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)修复信号传导，在DNA复制、基因转录调控和端粒结构维持等方面发挥重要作用[1]。DNA-PKcs和Ku70/Ku80二聚体在多种病变组织内存在异常表达，与基因组不稳定和细胞凋亡密切相关[2- 3]。病理状态下，脂多糖及细胞因子等能够诱导心肌细胞产生大量的一氧化氮(nitric oxide, NO)，发挥不良反应，参与心肌损伤、凋亡和心脏移植后排异等病理反应[4]。有关NO 对心肌细胞损伤修复机制的影响尚未见报道，自由基清除剂的作用也未得到验证。本研究在体内外环境下NO供体硝普钠和自由基清除剂对心肌细胞DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表达的影响，为自由基清除剂保护心肌细胞抵抗NO损伤的机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

兔抗人Ku70/80单克隆抗体(Anbo公司)，小鼠抗人DNA-PKcs多克隆抗体(Abcam公司)，小鼠抗人β-actin单克隆抗体、胰蛋白酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和硝普钠(Sigma公司)，蛋白提取液(Pierce公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔/羊抗鼠IgG、PBS(北京中杉公司)，DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司)。

1.2 细胞及培养

H9C2 心肌细胞系由南昌大学第二附属医院心研所赠送(中国科学院上海细胞库)，用含10%胎牛血清的高糖改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified eagle medium, DMEM)培养基，在37 ℃，体积分数为0.05的CO2及饱和湿度的恒温箱中孵育培养， 每2～3 天传代1次。待细胞汇合至80%后，按照不同分组采用不同处理方式：一组随机分成4个亚组, 培养皿中加入 SNP, 终浓度分别0、10、20和40 mmol/L; 另一组随机分成单纯 SNP组、 SNP+SOD组、SNP+ CAT组和SNP+SOD+CAT 组,其中加入SNP、SOD 和CAT的终浓度分别为 40 mmol/L、50 U/mL和50 U/mL。以上细胞均在共培养6 h 后，常规方法提取细胞总蛋白备行Western blot检测。

1.3 动物模型的建立

SD大鼠40只，雄性，体质量150～170 g [江西中医学院,许可证号：SCXK(赣)2010- 0001]。随机分为5组，每组8只：对照组(0.9% NaCl溶液1.5 mL)、SNP组(40 mmol/L SNP 0.5 mL+NaCl溶液 1 mL)、SNP+SOD组(SNP 0.5 mL+50 U/mL SOD 0.5 mL+NaCl溶液0.5 mL)、SNP+ CAT组(SNP 0.5 mL+ 50 U/mL CAT 0.5 mL+NaCl溶液0.5 mL)、SNP+SOD +CAT组(各0.5 mL)。隔日1次，连续1周(共3次)，于最后1次注射后24 h处死，取心脏组织置于4%甲醛溶液保存以备免疫组织化学检测使用。

1.4 Western blot检测DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表达

根据蛋白相对分子质量分别行不同浓度(8%～10%) SDS-PAGE，将分离后的蛋白质转移至硝酸纤维膜上，封闭1 h，分别加入小鼠抗人DNA-PKcs多克隆抗体(1∶2 000)、兔抗人Ku70/80单克隆抗体(1∶2 000) 和小鼠抗人β-actin单克隆抗体(1∶4 000)， 4 ℃孵育过夜。TBST漂洗10 min，共4次。羊抗兔或羊抗鼠辣根过氧化物酶标记二抗(1∶5 000)4 ℃孵育4～6 h。TBST漂洗10 min，共4次。SuperSignal West Femto敏感曝光试剂盒曝光底片，然后采用Gel-Pro analyzer 4软件分析底片上蛋白条带灰度值，并以β-actin作为参照，计算目的蛋白相对表达量。

1.5 免疫组织化学法检测DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表达

按照免疫组织化学一步法染色试剂盒说明书进行操作，DNA-PKcs和Ku70/80作为特异性一抗进行免疫组化染色(DNA-PKcs浓度1∶400; Ku70/80浓度1∶3 500)，以出现黄色颗粒且染色强度高于背景的非特异性着色细胞为阳性细胞。在高倍镜(×200)下随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，按阳性细胞数的平均百分率计分。0～5%计0分，5.1%～25%计1分，25.1%～50%计2分，50.1%～75%计3分，>75%计4分。染色强度按多数阳性细胞呈现的染色特征计分。未着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。免疫组化得分为阳性细胞百分率和染色强度的计分之积。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 H9C2细胞DNA-PKcs和Ku70/80的表达

10、20和40 mmol/L的SNP与心肌H9C2细胞共培养6 h后，心肌细胞的DNA-PKcs和Ku70/80蛋白相对表达量均较对照组显著升高(图1, 表1)。

图1 Western blot检测不同浓度SNP对心肌H9C2细胞DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表达的影响Fig 1 Western blot assay shows the expression of DNA-PKcs and Ku70/80 protein in H9C2 cells treated with different concentration of SNP

groupDNA⁃PKcsKu70/80control11SNP(mmol/L)10128±005180±00120131±007302±01840190±006304±014

2.2 SOD和CAT对心肌H9C2细胞DNA-PKcs和Ku70/80表达的影响

SOD或CAT或二者合用, 均降低DNA-PKcs和Ku 70/80蛋白表达水平。DNA-PKcs在SNP+SOD组、SNP+CAT组和SNP+SOD+CAT组的表达均显著低于SNP组(P<0.01)。Ku70/80在SNP+SOD组和SNP+SOD+CAT组的表达显著低于SNP组(P<0.05)，SNP+SOD组显著低于SNP+CAT组 (P<0.05)，SNP+SOD+CAT组显著低于SNP+CAT组(P<0.05)(图2, 表2)。

图2 SNP、SOD和CAT对心肌细胞DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表达的影响Fig 2 The expression of DNA-PKcs and Ku70/80 protein in cells treated with SNP, SNP+ SOD,SNP+CAT or SNP+SOD+CAT

groupDNA⁃PKcsKu70/80control11SNP130±006329±056SNP+SOD033±003128±003SNP+CAT038±005220±026SNP+SOD+CAT046±014120±005

2.3 SNP、SOD和CAT对大鼠心肌组织DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表达的影响

DNA-PKcs蛋白表达在正常大鼠心肌组织呈阴性(图3A)，SNP组呈强阳性(图3B)，SNP+SOD组呈阳性(图3C)，SNP+CAT组呈阳性(图3D)，SNP+SOD+CAT组呈阳性(图3E)。此外，SNP+SOD组、SNP+CAT组和SNP+SOD+CAT组的DNA-PKcs免疫组化得分均显著高于正常对照组(P<0.05)，SNP+SOD组显著低于SNP组(P<0.05)，SNP+SOD+CAT组显著低于SNP组、SNP+SOD组和SNP+CAT组(P<0.05) (图4)。

A.DNA-PKcs expression in control group; B.DNA-PKcs expression in SNP group; C.DNA-PKcs expression in SNP+SOD group; D.DNA-PKcs expression in SNP+CAT group; E.DNA-PKcs expression in SNP+SOD+CAT group; F.Ku70/80 expression in control group; G.Ku70/80 expression in SNP group; H.Ku70/80 expression in SNP+SOD group; I.Ku70/80 expression in SNP+CAT group; J.Ku70/80 expression in SNP+SOD+CAT group

图3 免疫组织化学检测SNP、SOD和CAT对心肌组织DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表达的影响

Fig 3 Immunohistochemical staining shows DNA-PKcs and Ku70/80 expression in myocardial tissues of rats treated

with SNP, SNP+SOD,SNP+CAT or SNP+SOD+CAT (DAB staining, magnification×200 and ×400)

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with SNP

Ku70/80蛋白表达在正常大鼠心肌组织呈阴性(图3F)，SNP组呈强阳性(图3G)，SNP+SOD组呈强阳性(图3H)，SNP+CAT组呈强阳性(图3I)，SNP+SOD+CAT组呈阳性(图3J)。此外，SNP组、SNP+SOD组、SNP+CAT组和SNP+SOD+CAT组的Ku70/80免疫组化得分均显著高于对照组(P<0.0001)，SNP+SOD+CAT组得分显著低于SNP组、SNP+SOD组和SNP+CAT组(P分别<0.001, <0.001, <0.01)(图4)。

3 讨论

过量的NO对心肌细胞产生不良反应，造成心肌细胞DNA 的断裂、损伤，甚至细胞死亡。而自由基清除剂如SOD和CAT 对此有保护作用[5- 6]。大量动物实验证实了自由基清除剂具有灭活NO和抑制eNOS活性的功能，对心肌细胞和血管内皮细胞大有裨益[7- 8]。

本研究发现，H9C2细胞DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表达水平均随着SNP浓度的增高而增高，说明高浓度的NO供体SNP能够刺激心肌细胞NHEJ通路两个关键启动因子的高表达，产生一个异常增强的易错修复活动，从而导致心肌细胞的修复错误和细胞凋亡等发生。自由基清除剂SOD和CAT或者二者则可以有效扼制SNP对DNA-PKcs和Ku70/80的诱导作用，提示SOD和CAT在一定程度上对心肌细胞对抗NO损伤起着保护作用，二者联用时效果最好。SNP能够诱导心肌细胞DNA-PKcs和Ku70/80的高表达，导致异常修复，与细胞致死性损伤和凋亡相关。SOD和CAT均可以减弱SNP对于DNA-PKcs的激活作用，此外，联合使用自由基清除剂SOD和CAT能够最好地抑制SNP对细胞NHEJ启动蛋白DNA-PKcs和Ku70/80的诱导作用，从而降低细胞发生错误修复和细胞损伤加剧的发生，维持细胞稳定和正常生理功能。

本研究结果显示SNP能够通过诱导心肌细胞的DNA-PKcs和Ku70/80的高表达，从而促使NHEJ易错修复活动的异常活化，而SOD和CAT则可以抑制SNP的这一作用，尤以二者联用时效果最佳。

[1] Kloosterman WP, Tavakoli-Yaraki M, van Roosmalen MJ,etal. Constitutional chromothripsis rearrangements involve clustered double-stranded DNA breaks and nonhomologous repair mechanisms[J]. Cell Rep, 2012,1:648- 655.

[2] Truong LN, Li Y, Shi LZ,etal. Microhomology-mediated End Joining and Homologous Recombination share the initial end resection step to repair DNA double-strand breaks in mammalian cells[J]. Pro Natl Acad Sci U S A, 2013,110:7720- 7725.

[3] Dalby AB, Goodrich KJ, Pfingsten JS,etal. RNA recognition by the DNA end-binding Ku heterodimer[J]. RNA, 2013,19:841- 851.

[4] 戴日新 李浪.心肌细胞凋亡信号传导通路与心肌损伤[J] 基础医学与临床, 2010,30: 775- 777.

[5] Lee SR, Lee SJ, Kim SH,etal. NecroX- 5 suppresses sodium nitroprusside-induced cardiac cell death through inhibition of JNK and caspase-3 activation[J]. Cell Biol Int, 2014,38:702- 707.

[6] 燕子, 郭丽, 杨丽红, 等.iNOS在大鼠创伤模型心肌细胞凋亡中的作用[J] 基础医学与临床, 2013,33: 675- 679.

[7] Didion SP, Ryan MJ, Baumbach GL,etal. Superoxide contributes to vascular dysfunction in mice that express human renin and angiotensinogen[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002,283:1569- 1576.

[8] Yan C, Huang A, Wu Z,etal. Increased superoxide leads to decreased flow-induced dilation in resistance arteries of Mn-SOD-deficient mice[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2005,288:2225- 2231.

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做义工有助于降低高血压风险

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Sodium nitroprusside and SOD decrease the expression of DNA-PKcs and Ku70/80 of rats cardiomyocytes

JIANG Wen1, LI Wei2, ZHOU Cheng-bin1*

(1.Guangdong Cardiovascular Institute, Southern Medical University, Guangzhou 510080; 2.Dept. of Orthopedics, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Objective To determine the effects of Sodium Nitroprusside (SNP), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) on the expression of catalytic subunit of the DNA-dependent protein kinase (DNA-PKcs) and Ku70/80 heterodimer in cardiomycyte H9C2, as well as their expression in the myocardial tissues of SD rats. Methods H9C2 cells were co-cultured with SNP at concentreations of 10, 20 and 40 mmol/L for 6 hours, SD rats were injected with normal saline, SNP, SNP+SOD, SNP+CAT or SNP+SOD+CAT. Western blot and immunohistochemistry assay were used to examine DNA-PKcs and Ku70/80 protein expression respectively. Results The expression of DNA-PKcs and Ku70/80 increased in H9C2 cells co-cultured with SNP when compared with control group, but they were be decreased when treated with SOD or/and CAT. The expression of DNA-Pkcs and Ku70/80 in myocardial tissues of experimental groups were higher than the control. Conclusions Radical scavengers may

play a role as a protective effect for sodium nitroprusside related injury in cardiac myocytes.

sodium nitroprusside; radical scavengers; cardiomycyte; catalytic subunit of DNA-dependent protein kinase; Ku70/80 heterodimer

2014- 05- 08

2014- 10- 08

1001-6325(2015)01-0074-05

R3

A

*通信作者(corresponding author)：zcbwwww@163.com