大豆异黄酮减轻反式脂肪酸诱导的大鼠动脉粥样硬化

宓 伟，赵 倩，宓思婕，练 武，石塔拉

(1.滨州医学院 公共卫生与管理学院 营养与食品卫生学教研室， 山东 烟台 264003；2.平邑县人民医院 重症监护室， 山东 临沂 273300)



研究论文

大豆异黄酮减轻反式脂肪酸诱导的大鼠动脉粥样硬化

宓 伟1*，赵 倩1，宓思婕2，练 武1，石塔拉1

(1.滨州医学院 公共卫生与管理学院 营养与食品卫生学教研室， 山东 烟台 264003；2.平邑县人民医院 重症监护室， 山东 临沂 273300)

目的观察大豆异黄酮减轻反式脂肪酸诱导的大鼠动脉粥样硬化的作用。方法 将大鼠随机分为普通饲料组、反式脂肪酸组、大豆异黄酮组和反式脂肪酸+大豆异黄酮组，用试剂盒分别测量血中TG、HDL、LDL、IL- 6和TNF-α的含量；培养牛主动脉内皮细胞，分为对照组、反式脂肪酸组和反式脂肪酸+大豆异黄酮组，Western blot法检测牛主动脉内皮细胞内NF-κB的磷酸化，同时检测细胞间黏附因子- 1(ICAM- 1)与血管细胞黏附因子(VCAM- 1)蛋白表达。结果与普通饲料组比较，反式脂肪酸组血TG、LDL、IL- 6和TNF-α明显升高(P<0.05)，HDL显著降低(P<0.05)。大豆异黄酮干预后，血中TG、LDL、IL- 6和TNF-α均降低(P<0.01)，HDL显著升高(P<0.01)。大豆异黄酮能降低反式脂肪酸诱导的NF-κB磷酸化(P<0.01)；与对照组比较，大豆异黄酮能使反式脂肪酸诱导的ICAM- 1和VCAM- 1的表达降低(P<0.01)。结论大豆异黄酮可减轻反式脂肪酸诱导的大鼠动脉粥样硬化作用。

大豆异黄酮；反式脂肪酸；动脉粥样硬化

反式脂肪酸(trans fatty acids,TFA)是一类含有反式非共轭双键的不饱和脂肪酸的总称，主要来自氢化油和高温加热后的油脂，人体难以消化此类不饱和脂肪酸，滞留于体内可明显增加患心血管疾病的概率[1]。流行病学研究显示：TFA可改变人体血脂组成、干扰正常的脂质代谢、刺激系统炎性反应诱导内皮细胞损伤和凋亡，并进一步导致心血管疾病的发生和进展[2]。大量研究证实大豆异黄酮(soybean isoflavone，SI)对骨质疏松症、心血管疾病、癌症和更年期综合征具有预防效果[3]。自然界中异黄酮资源十分有限，大豆是唯一含有异黄酮且含量在营养学上有意义的食物资源[4]。SI能降低血胆固醇、甘油三酯(triglycerid，TG)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)，同时升高高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)，对动脉粥样硬化的预防作用显著。但大豆异黄酮减轻反式脂肪酸诱导的动脉粥样硬化的研究还未见报道。本实验探讨大豆异黄酮干扰反式脂肪酸诱导动脉粥样硬化的细胞信号通路，为临床利用大豆异黄酮防治动脉粥样硬化及其新药开发提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

TFA，纯度>96%(上海作舟化工科技有限公司)；SI，纯度>91%(四川广瀚生物技术有限公司)；TG、HDL、LDL、IL- 6和TNF-α试剂盒(北京经纬博恒生物科技开发有限责任公司)；BAEC牛主动脉内皮细胞(广州吉妮欧生物科技有限公司)；细胞间黏附因子- 1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM- 1)和血管细胞黏附因子(vascular cell adhesion molecule，VCAM- 1)试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司)；兔抗人ICAM- 1多抗和VCAM- 1多抗、鼠抗人β-tubulin单抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体(Sigma公司)。

1.2 实验动物及分组

SPF级80只雄性SD大鼠，体质量190±20 g[滨州医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(鲁)2010- 0012]。

将大鼠随机分为普通饲料对照组(normal diet)、反式脂肪酸组(TFA)、大豆异黄酮组(SI)和反式脂肪酸+大豆异黄酮组(TFA+SI)。置于标准动物房中，每笼5只，适应动物房环境1周。

4组饲料配制参照文献[5]。

1.3 大鼠血脂生化指标的检测

实验开始大鼠断尾取血，使用试剂盒检测血中TG、LDL、HDL、IL- 6和TNF-α含量。

按各组饲料进行喂养，11周时，大鼠断头处死取血，检测指标同上。

1.4 牛主动脉内皮细胞培养

将购买的牛主动脉内皮剪碎，用胶原蛋白酶处理，即可得到单个的牛主动脉内皮细胞。将处理后的细胞分别接种于含有TFA、TFA+SI和空白的DMEM生长液中(均含10%小牛血清)，置于5% CO2，37 ℃，饱和湿度下常规培养。

1.5 Western blot检测NF-κB磷酸化及ICAM- 1和VCAM- 1蛋白表达

大豆异黄酮浓度120 mg/L，反式脂肪酸浓度50 mg/L，方法参照文献[6]，Western blot法检测NF-κB磷酸化。

Western blot法检测ICAM- 1和VCAM- 1蛋白表达参照文献[7]，结果以目的蛋白和内参电泳条带的吸光度比值来表示。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 实验前后血脂生化指标比较

TFA组与普通饲料组比较，血TG和LDL水平明显升高，而HDL显著降低(P<0.05)。SI干预后，TG和LDL水平显著降低，而HDL显著升高(P<0.01)，单纯SI组与普通饲料组比较，TG、LDL水平均降低，而HDL明显升高(P<0.05)(表1)。

2.2 实验前后血IL- 6和TNF-α水平的比较

实验后TFA组与普通饲料组比较，血IL- 6和TNF-α水平均明显升高(P<0.05),实验后TFA+SI组与TFA组比较，血IL- 6和TNF-α水平均明显下降(P<0.01)(表2)。

2.3 Western blot检测结果

2.3.1 NF-κB活性:TFA组NF-κB活性在5、10、15、20和30 h分别为：6.54±2.13、7.65±2.89、8.14±2.56、10.25±3.12和12.47±2.36，与对照组(5.34±2.07)比较随着时间延长而增强(P<0.05)。SI干预后NF-κB活性在5、10、15、20和30 h分别为：4.78±2.54、2.15±1.89、1.14±1.01、0.52±0.12和0.45±0.14，与对照组(5.34±2.07)比较，活性随时间逐渐下降(P<0.01)(图1)。

表1 各组大鼠实验前后TG、HDL和LDL水平的比较

groupbeforetheexperimentaftertheexperimentTG(mol/L)HDL(mol/L)LDL(mol/L)TG(mol/L)HDL(mol/L)LDL(mol/L)normaldiet152±056181±089348±124 151±057 189±075 338±128TFA146±034164±075313±109 305±123∗ 089±069∗ 598±158∗SI151±054174±068321±107 075±054∗ 314±056∗ 123±114∗TFA+SI163±084175±074309±115 132±087∗∗ 178±064∗∗ 289±117∗∗

*P<0.05 compared with normal diet group；**P<0.01 compared with TFA group.

表2 各组大鼠实验前后血IL- 6和TNF-α水平的比较

*P<0.05 compared with normal diet group；**P<0.01 compared with TFA group.

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group

2.3.2 IACM- 1和VCAM- 1检测结果:TFA组IACM- 1 在8、16和24 h蛋白相对含量分别为：(2.31±1.14)、(4.32±1.54)和(7.25±2.15)，较对照组(0.89±0.56)明显升高(P<0.01)。SI干预后IACM- 1蛋白的表达与对照组比较无明显变化(图2)。

图2 Western blot 法检测各组ICAM- 1蛋白的表达Fig 2 The expressions of ICAM- 1 protein in different groups tested by Western blot

TFA组VCAM- 1 在8、16和24 h蛋白相对含量分别为：4.24±2.12、6.44±2.25和8.67±2.78，较对照组(1.85±1.16)明显升高(P<0.01)。SI干预后VCAM- 1蛋白的表达与对照组比较无明显变化(图3)。

图3 Western blot 法检测各组VCAM- 1蛋白的表达Fig 3 The expressions of VCAM- 1 protein in different groups tested by Western blot

3 讨论

动脉粥样硬化死亡人数占全国总死亡人数的30%，且发病有年轻化趋势[8]。大量研究已证明，反式脂肪酸在体内蓄积，损伤内皮细胞功能，导致炎性反应， 促进动脉粥样硬化的发生[9]。而包括动脉

粥样硬化在内的一些慢性疾病的低发病率都与大豆及豆制品的膳食量有关，特别是大豆异黄酮具有潜在的减轻动脉粥样硬化的效应[10]。

NF-κB是重要的炎性反应和应激反应信号分子，几乎存在于所有细胞中，广泛参与机体防御反应及组织损伤等过程。从本结果IL- 6、TNF-α和ICAM- 1、VCAM- 1的变化，可初步推断反式脂肪酸致动脉粥样硬化的机制和大豆异黄酮的保护作用：反式脂肪酸集聚人体不消化，导致体内TG和LDL升高，HDL降低，高水平的TG及LDL在内膜某一部位累积进行氧化和糖基化修饰，使该部位内皮细胞受到应激，出现受损。受损内皮细胞大量释放IL- 6及TNF-α等炎性因子。TNF-α反作用于内皮细胞上的TNF-α受体，与其结合，激活了细胞内的IκB激酶。后者作用于无活性的复合物IκB-NFκB，使其发生磷酸化，释放出有活性的NF-κB。NF-κB进而作用于细胞系，使受损内皮细胞高度表达ICAM- 1和VCAM- 1。在ICAM- 1和VCAM- 1介导下，单核细胞、淋巴细胞和血小板黏附并集聚于受损部位，进而形成斑块，从而引发了动脉粥样硬化的发生。而大豆异黄酮可使体内的TG及LDL降低，HDL升高，从源头上制止了TG及LDL对血管的损害。大豆异黄酮还可降低血中IL- 6及TNF-α水平，抑制NF-κB通路，减少细胞表面ICAM- 1及VCAM- 1的表达，在一定程度上减慢了动脉粥样硬化的进展。因此，大豆异黄酮具有预防动脉粥样硬化的作用，有一定的研究和开发价值。

本实验表明大豆异黄酮对反式脂肪酸致动脉损伤保护机制与细胞通路有关，但大豆异黄酮是通过改变反式脂肪酸的结构，还是与TNF-α进行受体竞争或是其他因素来抑制反式脂肪酸诱导的动脉粥样硬化确切机制仍不清楚，尚待进一步的研究。

[1] Santos Bruno dos, Estadella Debora, Losinskas Hachul Ana Cláudia,etal. Effects of a diet enriched with polyunsaturated,saturated,or trans fatty acids on cytokine content in the liver,white adipose tissue,and skeletal muscle of adult mice [J]. Hindawi Publishing Corporation Mediators of Inflammation, 2013,21:1- 10.

[2] Maitan-Alfenas Gabriela P, Lage Lorena G. de A, De Almeida Maíra N,etal. Hydrolysis of soybean isoflavones by Debaryomyces hansenii UFV- 1 immobilised cells and free β-glucosidase [J]. Food Chemistry,2014, 146: 429- 436.

[3] Li Gang, Jiang Yang, Fan Xin-jiong,etal. Molecular cloning and characterization of a novel β-glucosidase with high hydrolyzing ability for soybean isoflavone glycosides and glucose-tolerance from soil metagenomic library [J]. Bioresource Technology, 2012, 123: 15- 22.

[4] Chennupati Pratyusha, Seguin Philippe, Chamoun Rony,etal. Effects of high-temperature stress on soybean isoflavone concentration and expression of key genes involved in isoflavone synthesis [J]. American Chemical Society, 2012, 60: 12421- 12427.

[5] Takeuchi Hiroyuki, Kutsuwada Taiki, Shirokawa Yutaka,etal. Supplementation with 1% energy trans fatty acids had little effect on serum cholesterol levels in healthy young japanese women [J]. Biosci.Biotechnol.Biochem, 2013, 77: 1219- 1222.

[6] 徐艳杰，程晓曙. 巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇代谢与动脉粥样硬化[J]. 基础医学与临床，2013, 33: 235- 238.

[7] Ismailov Rovshan M. Circle of Willis atherosclerosis,Alzheimer’s disease and the dean number [J]. World Journal of Cardiology, 2013, 5: 394- 396.

[8] 彭洁，郭媛. ATP结合盒转运体A1基因变异与冠心病的研究进展 [J]. 基础医学与临床，2012，32: 1107- 1110.

[9] 项荣，严经纬，范亮亮，等. 动脉粥样硬化中炎性反应与内质网应激的相互作用[J]. 基础医学与临床，2014，34: 253- 256.

[10] Behloul N,Wu G. Genistein: a promising therapeutic agent for obesity and diabetes treatment [J]. European Journal of Pharmacology,2013, 8: 31- 38.

新闻点击

3岁饮食决定成年心脏病风险

据英国《BBC新闻》(BBC NEWS)2013-06-24报道，加拿大新近研究发现，不健康的饮食对人体的影响，比先前研究所认定的时间还要早许多。年纪仅3～5岁的儿童，其有些饮食会导致胆固醇浓度明显升高，进而增加成年时期患心脏病的风险。因此，为保护成人心脏健康，人为介入应更早实施。

研究人员说，幼儿3岁的饮食或能决定成年人患心脏病的风险。幼年时期不健康的饮食习惯，致使3～5岁儿童产生显著的胆固醇征兆。

加拿大圣麦克医院(St Michael’s Hospital)的研究人员说，这表明保护健康的干预措施可以更早进行。

研究成员佩尔绍德(Navindra Persaud)博士说：“幼儿时期的饮食和患心血管疾病风险之间存在关连性。3～5岁儿童体内血清非高密度脂蛋白胆固醇(serum non-HDL cholesterol)浓度，与家长所报告的饮食行为呈正相关。”

她说：“排除年龄、性别、出生体质量、父母身体质量指数(BMI)、妊娠期糖尿病和父母种族等因子后，幼童饮食行为和血清非高密度脂蛋白胆固醇浓度之间的关连性持续存在。”

她表示，研究结果支持采取干预措施的论点，可改善学龄前孩童的饮食行为。先前的证据表明，为达到这个目标，可增强幼儿需求的回应式喂食(Responsive feeding)，也就是说提供合适的健康食物，以及根据儿童行为的内在暗示(internal cues)，以决定确切喂食的时机、饮食快慢及孩童的摄取量。

Soybean isoflavone attenuates trans fatty acids-induced atherosclerosis in rats

MI Wei1*, ZHAO Qian1, MI Si-jie2, LIAN Wu1, SHI Ta-la1

(1.Dept. of Nutrition and Food Hygiene,College of Public Health and Management, Binzhou Medical University, Yantai 264003; 2.Intensive Care Unit,Pingyi People’s Hospital, Linyi 273300, China)

Objective To observe the effects of soybean isoflavone in attenuating trans fatty acids-induced atherosclerosis in rats.Methods The rats were randomly divided into normal diet group、trans fatty acids group、soybean isoflavone group and trans fatty acids+soybean isoflavone group. Research kit was used to test the amounts of TG,HDL,LDL and IL- 6,TNF-α in rats’ blood.Bovine aortic endothelial cells were cultured and divided into control group,trans fatty acids group and trans fatty acids group+soybean isoflavone group.Western blot was performed to test the NF-κB phosphorylation,as well as to determine ICAM- 1 and VCAM- 1 protein contents in bovine aortic endothelial cells.Results Compared with normal diet group,the amounts of TG,LDL,IL- 6,TNF-α increased evidently(P<0.05), whereas the amounts of HDL decreased evidently (P<0.05) in the rats’blood of trans fatty acids group.After the soybean isoflavone intervened,the amounts of TG,LDL,IL- 6,TNF-α all decreased(P<0.01), meanwhile the amounts of HDL increased significantly(P<0.01). Soybean isoflavone inhibited NF-κB phosphorylation induced by trans fatty acids(P<0.01). The high expression of ICAM- 1 and VCAM- 1 induced by trans fatty acids was decreased by soybean isoflavone when comparing with those in the control group(P<0.01). Conclusions Soybean isoflavone has a role in attenuating trans fatty acids trans fatty acids-induced atherosclerosis in rats.

soybean isoflavone; trans fatty acids; atherosclerosis

2014- 05- 26

2014- 07- 18

国家自然科学基金(81302423)；滨州医学院科技计划(BY2013KJ86)

1001-6325(2015)01-0007-05

R331.1

A

*通信作者(corresponding author)：miweinew@163.com