猪肺脏巨噬细胞的分离培养

张岩岩，胡亚萍，张雪梅，刘 欢，王 鹏，王钦富

（大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622）

猪肺脏巨噬细胞的分离培养

张岩岩，胡亚萍，张雪梅，刘 欢，王 鹏，王钦富*

（大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622）

提取分离猪肺泡巨噬细胞（PAM）、猪肺血管巨噬细胞（PIM）、猪肺间质巨噬细胞（IM）三种细胞并进行体外培养，采用免疫组化和流式细胞术进行细胞的异质性研究。无菌条件下通过支气管肺泡灌洗获取PAM，右心室插管经心脏行肺血管原位灌注的方法分离得到PIM，肺组织机械处理结合酶消化法(胶原酶IA)分离IM。显微镜下观察三种细胞的形态上的不同；免疫组化和流式细胞术检测细胞表型。三种巨噬细胞形态有明显的不同，PAM较大，表面粗糙，PIM和IM较小，并且细胞光滑；PAM细胞大多为CD163阳性，IM和PIM则CD86阳性较多。PAM、PIM、IM在形态和表型上存在异质性。

猪肺泡巨噬细胞；猪肺血管巨噬细胞；猪肺间质巨噬细胞

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞之一，它可以识别并对侵入组织和血液中的病原体做出迅速反应，进一步激发炎症反应，激活体内免疫反应，最后清除病原体并维护内环境的稳态[1]。炎症是机体对体内外损伤性因素产生的病理生理性反应，适度的炎症反应对机体是有利的，有助于清除感染、异物、老化细胞等，但是过度或持续的炎症反应则会造成不同程度的组织损伤。有研究表明炎症与肥胖、肿瘤、感染（慢性感染）、糖尿病、代谢综合征、关节炎、动脉粥样硬化等多种疾病病理过程的发生和发展密切相关[2-4]。甚至认为肿瘤、糖尿病、关节炎等难以攻克的重大疾病本身就是一种难以治愈的―炎症”[5]。近来研究发现，巨噬细胞在代谢性疾病中既可以发挥促炎作用，同时还能抑制炎症的发生[6-7]。

肺泡巨噬细胞（PAM）是机体抵御外来微生物侵袭肺脏的第一道防线，不仅具有吞噬和抗原提呈功能，还能分泌多种生长因子、前列腺素、白介素、补体、肿瘤坏死因子等调节和启动免疫炎性反应。肺间质巨噬细胞（IM）常被看作是一个细胞发育期间的中间物[8]。肺血管巨噬细胞（PIM）是肺巨噬细胞亚群之一，位于肺泡壁毛细血管腔内，紧贴于毛细血管内细胞表面，吞噬、分泌功能非常活跃，是肺防御的主要成员。三种巨噬细胞是肺内最主要的三种巨噬细胞亚群，正常情况下两者存在明显的异质性，表现在形态、结构、功能及表型等方面[9]。随着对各大疾病的深入研究，几乎所有疾病的发生发展都与免疫息息相关，巨噬细胞原始起源于骨髓而后最终填充到身体的其他领域发挥作用。实验主要在建立了猪的这三种细胞分离纯化方法的基础上，研究它们在形态及功能上的差异。为进一步研究肺内巨噬细胞亚群间的异质性提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

仔猪购自大连金州某规模养殖场15天左右的健康小乳猪。处死之前让其自由的进食及饮水，静脉放血至死。

1.1.2 主要试剂

氨苄青霉素6 mg（1mg约1670单位）、硫酸链霉素13 mg（1mg约798单位）、1640细胞培养液、胎牛血清、硝酸钠、Hanks液、PBS、柠檬酸缓冲液，均购自上海生物工程有限公司；96孔细胞板购自Costar公司；胶原酶IA购自sigma。Anti-CD163/PE Conjugated、Anti-CD86/pE Conjugated，购自上海益欣生物科技有限公司；磷酸二氢钾、无水乙醇、柠檬酸三钠，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸氢二钠，购自国药集团化学试剂有限公司；二甲苯，购自辽宁新兴试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肺组织石蜡切片免疫组化技术

取正常猪肺组织切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm大小，将组织分别放入75%、85%、90%、95%、100%梯度脱水各1 h；然后放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各1h进行透明；再分别放入54℃石蜡浸蜡1 h，室温冷却、切片。在60度的烤箱中烘烤切片5 min，石蜡切片脱蜡后用PBS洗2次每次5 min。抗原修复：微波炉30min，浸泡在装满柠檬酸盐缓冲液的染色盒中；冷却到室温再用PBS洗3次每次5 min。5%正常牛血清（PBS稀释）封闭，室温孵育20 min，倾去血清，勿洗。滴加稀释一抗工作液，4℃过夜。PBS冲洗3次，每次5 min。滴加适量荧光标记二抗工作液，室温孵育1 h后PBS冲洗3次。荧光显微镜观察拍照。

1.2.2 PAM的分离培养

取仔猪肺脏，用漏斗将约200 mL无菌、4℃预冷的 PBS从气管灌入肺脏内；轻轻按摩肺叶后倒出支气管肺泡灌洗液；重复上述冲洗过程3～4次，将每次得到的灌洗液混合在一起，100目不锈钢筛网过滤；低温冷冻离心机（4℃）离心10 min，转速为1500 r/min，收集细胞，用无血清的培养液洗涤细胞2次；加入 RPMI-1640（10%胎牛牛血清），于 37℃ 5%CO2、饱和湿度条件下贴壁2 h，弃去未贴壁的细胞，贴壁生长的细胞即为PAM。

1.2.3 PIM的分离培养

从右心室插管经心脏行肺血管原位灌注，依次用0.75%硝酸钠溶液250 mL消化血管壁上的血细胞；无钙、镁Hanks液配制的0.04% EDTA Na21000 mL清洗肺血管腔；5ml 2.75% CaCl2溶液加入 250 mL 0.025%胶原酶溶液，以此新鲜配制的胶原酶液灌注，以使 PIM 与肺血管内皮细胞分离，并于此时开始自左心室插管收集灌注液；最后用无钙、镁Hanks液灌注，收集灌洗液1500 r/min离心10 min，Hanks液清洗，含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，于37℃ 5%CO2、饱和湿度条件下贴壁2 h，洗弃未贴壁的细胞，贴壁生长的细胞即为PIM。

1.2.4 IM的分离培养

将灌洗后的肺组织剪碎至 1 mm3以下，加入0.025%胶原酶IA，在37℃恒温培养箱中消化60 min，200目不锈钢筛网过滤，收集到的组织消化液 1500 r/min离心10 min，10%胎牛血清的RPMI-1640重悬细胞，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下贴壁2 h，洗去未贴壁细胞，贴壁生长的细胞即为IM。

1.2.5 细胞形态的观察

12孔板接种细胞，PAM、PIM、IM的细胞密度为2×106个/mL。光学显微镜40倍镜下观察PAM、PIM、IM形态。

1.2.6 流式细胞术鉴定PAM、PIM、IM细胞膜蛋白CD86、CD163的表达

弃掉12孔板上层细胞培养液，PBS洗一遍，加1 mL2 mMEDTA消化细胞2 min；加2 mL培养液终止消化；查细胞数，稀释，流式细胞术检测时每管500 uL，细胞数不少于 1万个；流式管离心后剩余100 uL液体，按1∶100加入1 ul抗体室温孵育2 h后，PBS加入500 uL，1500 r/min离心5 min去上清；加入PBS500 uL，上流式细胞仪测细胞膜蛋白的表达。

2 结果

2.1 肺组织石蜡切片免疫组化结果

猪肺脏组织做石蜡切片结果如图1。猪肺组织中PAM大多表现为CD163阳性，而CD86阳性极少；IM中CD163阳性很少，CD86阳性较多。肺组织石蜡切片免疫组化结果如图1。

图1 肺脏免疫组化结果

2.2 光学显微镜下细胞形态的观察

经肺泡灌洗，能得到大量的PAM，PAM细胞大、形态不太均一、表面粗糙；心脏行肺血管原位灌注的方法能得到纯化的PIM，机械方法处理肺组织，经酶消化可获取大量IM细胞，IM和PIM细胞形态均一、直径较小，并且细胞光滑。光学显微镜观察三种细胞形态，如图2。

图2 PAM、PIM、IM三种细胞形态（40×）

2.3 流式细胞术鉴定细胞膜蛋白CD86、CD163的表达结果

PAM、IM、PIM细胞表面CD163、CD86的表达量有较大的差异，结果如图3。根据图3可得如表1的统计结果，PAM细胞的CD163阳性率明显高于CD86，而PIM和IM的CD86阳性率高于CD163，并且PAM细胞的CD163阳性率高于PIM和IM的阳

性率，但CD86恰好相反。

图3 PAM、PIM、IM流式细胞术检测CD86、CD163结果

表1 流式细胞术检测数据统计学处理结果

3 讨论

猪肺巨噬细胞在猪的免疫反应中具有重要的角色，已知猪肺内含有不同形态、表型和功能的巨噬细胞亚群，包括肺泡巨噬细胞（PAM）、肺间质巨噬细胞（IM）和肺血管内巨噬细胞（PIM）[10]。PAM 对病原微生物的入侵性起着极其重要的作用，在抗感染免疫防御反应，吞噬和杀菌性能是其最基本的功能[11]。PIM 位于肺泡壁接近毛细管内细胞表面的毛细血管管腔，是肺巨噬细胞的重要亚群之一，是肺防御外界干扰的第一道防线，其吞噬、分泌功能非常的活跃。由于其所处的特殊部位，因此在肺部的急性炎症性疾病如急性肺损伤中的作用尤为引人注目。肺间质巨噬细胞（IM）是重要的免疫功能调节细胞[12]。可吞噬抗原，可通过细胞接触机制来影响DC始发的T细胞增殖，在IM小数量时IM可增强DC的功能，部分原因是其释放抗原肤，再由DC提呈给T细胞，但当IM数量超过50%时则抑制DC的功能，可能是由于释放了某种可溶性抑制因子的缘故[12]。

近年来，人们对巨噬细胞异质性的研究进展不断深入，已经不像以前的研究仅仅从细胞的形态、大小、表型和功能去区分不同类型的巨噬细胞，而是更多的关注巨噬细胞一些表面抗原、关键酶代谢、细胞因子的表达量等分子机制的研究。人们重视巨噬细胞异质性的研究，是为了更好的研究病变情况下的巨噬细胞变化，实验着重于研究巨噬细胞的异质性是为解决对大型养殖场以及人类饮食安全带来严重威胁的蓝耳病机理进行研究、预防和治疗。蓝耳病是由猪繁殖与呼吸系统综合症病毒（PRRSV）感染猪肺之后引起的猪肺部严重病变。PRRSV进入细胞之后利用巨噬细胞里的物质快速的进行复制和繁殖，在猪肺部形成局部感染后再扩散到全身组织[13]。猪繁殖与呼吸综合征不仅对大规模的养殖场造成十分严重的威胁，同时也给人类的饮食安全带来了很大的隐患，故研究猪肺巨噬细胞的异质性对猪蓝耳病的研究具有重要的意义。

目前多数巨噬细胞的获得都是采用灌洗法从大鼠、家兔肺内提取[14]。我们用灌洗法获取猪肺泡巨噬细胞（PAM）的方法取得较好的效果；右心室插管经心脏行肺血管原位灌注的方法分离得到PIM 的方法现有文献报道较少，获取细胞的效果较好，可以获得较单一的肺血管巨噬细胞，为后续试验做好基础工作；肺组织机械处理结合酶消化法提取IM细胞，效果很好，细胞获得数最多，但是要把握好酶作用的时间以免对细胞有害。

由体外培养观察猪肺脏巨噬细胞按照其部位可以分为PAM、PIM、IM多种亚群，光镜下PAM直径较大，大小不一，形态呈圆形、椭圆形或不规则形，表面粗糙，如图2（a）；PIM体积明显小于PAM，大小均一，形态多为圆形或者椭圆形，并且细胞光滑，如图2（b）；IM体积明显小于PAM，大小不一，形态多为圆形或者椭圆形，如图2（c）。目前有大量报道表明CD68为巨噬细胞共有的表面抗原，其在M1和M2中的表达量无差异。CD163在M2型细胞中的表达量明显比M1型的细胞要高，与M2型巨噬细胞相比M1型巨噬细胞中CD86的表达量要明显高[13]。免疫组化和流式细胞术检测表明 PAM 细胞大多为CD163阳性，IM和PIM则CD86阳性较多。在巨噬细胞异质性的研究中，巨噬细胞表面膜蛋白表达量的差异，在鉴定不用类型巨噬细胞的重要依据。实验在建立了这三种细胞分离纯化方法的基础上，观察它们在形态及表型上的差异。为进一步研究肺内巨噬细胞亚群间的异质性提供实验依据，PRRSV与巨噬细胞之间的相互作用对于分析PRRSV感染引起的免疫抑制和持续性感染的机制有十分重要的理论意义，并对其进形态学及其培养特性进行了初步研究，为进一步对其生物学功能研究奠定基础。

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The Porcine Lung Macrophages Isolation and Culture in Vitro

ZHANG Yan-yan, HU Ya-ping, ZHANG Xue-mei, LIU Huan, WANG Peng, WANG Qin-fu*
（College of Life Science and Technology, Dalian University, Dalian 116622, China）

Extracting and separating porcine alveolar macrophages (PAM), pulmonary intravascular macrophages(PIM), interstitial macrophages (IM), three types of cells in vitro, using immunohistochemical technique and flow cytometry. Aseptic conditions by bronchoalveolar lavage for PAM, right ventricular intubation via in situ perfusion line cardiac pulmonary vascular PIM, were isolated from lung tissue mechanical treatment combined with enzyme digestion method (collagenase IA) separation of IM. Immunohistochemistry and flow cytometry to detect cell phenotype and microscope different in three kinds of cell morphology. There is obvious difference in morphology between PAM, PIM and IM. PAM is bigger and rough surface, but PIM, IM are smaller and smooth surface. PAM are mostly CD163 positive cells, IM and PIM are mostly CD86 positive PAM, PIM and IM are heterogenous in morphology and phenotype.

PAM; IM; PIM

R392.12

A

1008-2395(2015)06-0066-04

2015-09-06

张岩岩（1988-），女，硕士研究生，研究方向：分子免疫学。

王钦富（1963-），男，教授，研究方向：兽医免疫学，分子免疫学。