改良抗酸染色法对儿童结核性脑膜炎诊断价值分析

曹晓娜，邵艳新，高 卿，苏 一，魏 媛，冯建纯

(1.辛集市第一人民医院 儿科，河北 辛集 052360;2.河北省胸科医院 检验科，河北 石家庄 050000)

结核性脑膜炎(结脑)是由于结核分枝杆菌(结核菌)侵犯脑膜引起的非化脓性炎症，是最严重的结核病，约占肺外结核病的6%，预后较差，病死率高达15% ～30%，误诊率高［1］，存活者可遗留不同程度的后遗症，如智力低下和(或)运动障碍等［2］。通过抗酸染色或培养在脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)中发现结核菌是明确结脑诊断的“金标准”［3］。但是离心涂片法的阳性率很低，培养法所需时间一般在4～8周左右，很多患者由于不能及时确诊而延误治疗。在2013年5月～2015年2月期间，我们共对30例临床诊断为结脑的儿童的脑脊液标本分别用BACTEC MGIT 960培养法、改良抗酸染色法［4－5］、离心涂片法进行检测，探讨改良抗酸染色法对儿童结脑的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 标本来源 本组30份CSF标本均取自辛集市第一人民医院2013年5月～2015年2月按临床诊断标准［6］诊断为结脑的儿童，其中男童17人，女童13人，年龄11个月～14岁，平均(7.8±1.5)岁，按送检先后纳入实验，均为有脑膜刺激征后初次送检的CSF。

1.2 临床特点 30例患者中，浸润型肺结核11例，合并血行播散型肺结核14例，骨结核3例，颈腋下淋巴结结核2例。临床症状以不同程度的发热、恶心、呕吐、盗汗、食欲不振、惊厥、烦躁、瘫痪、颈强直、视力障碍为主要表现，头颅影像学检查异常者29例。

1.3 脑脊液其他检查 颅压升高28例;白细胞数升高并且为以嗜中性粒细胞为主的混合细胞学反应30例;蛋白定量为0.45～2.0 g/L者27例，＞2.0 g/L 3例;糖定量＜2.5 mmol/L 29例，正常1例;氯化物＜120 mmol/L者29例，正常1例。

1.4 材料 玻片离心沉淀仪(Thermo Cytospin4型);BD公司BACTEC MGIT 960全自动结核菌快速鉴定仪;低温离心机;抗酸染色液;培养箱等。

1.5 检测方法

1.5.1 BACTEC MGIT 960培养法 取2 mL混匀的无菌CSF加入无菌离心管中，以3000 r/min低温离心15 min，小心将上清液尽量多地倒入含有消毒剂的容器中，加入0.5 mL的PBS混匀。将营养添加剂Growth Supplement倒入杂菌抑制剂PANTA试剂瓶，充分混匀，然后加入到MGIT液体培养管中，每管0.8 mL，最后加入0.5 mL标本进行培养。仪器报告阳性后取出行抗酸染色确认，阴性结果直接记录。

1.5.2 离心涂片法 取2 mL CSF加入一次性塑料管中，以3000 r/min低温离心15 min，轻轻弃掉上清液，吹打混匀试管底部沉渣进行涂片，火焰固定后，滴加石炭酸复红染液，染色10 min，3%盐酸酒精脱色1 min，美蓝复染0.5 min，水洗，自然干燥，然后用油镜检查并记录结果。详细内容参照《痰涂片镜检质量保证手册》［7］。

1.5.3 改良抗酸染色法 取0.5 mL混匀的 CSF加入Cytospin-4型玻片离心沉淀仪中，以450 r/min离心5 min(玻片用多聚赖氨酸处理)，取出玻片干燥后抗酸染色，油镜镜检。

1.6 统计学方法 分别计算3种方法的阳性率，采用SPSS 15.0统计软件进行分析，阳性率比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CSF结核菌培养 30例CSF结核菌培养阳性4例，阳性率13.3%，细菌的初生长时间为28～45 d。CSF的性状与培养阳性率直接相关，4例毛玻璃样混浊的CSF结核菌培养完全阳性。

2.2 改良抗酸染色法与BACTEC MGIT 960培养法、离心涂片法检测结果比较 30例CSF标本中，改良抗酸染色法阳性17例，阳性率56.7%，改良抗酸染色法明显高于BACTEC MGIT 960培养法，差异有统计学意义 (配对 χ2=11.05，P ＜0.005，表 1);离心涂片法阳性1例，阳性率3.33%，改良抗酸染色法明显高于离心涂片法，差异有统计学意义(配对 χ2=14.07，P ＜0.005，表2)。

表1 改良抗酸染色法与BACTEC MGIT 960培养法检测结果比较

表2 改良抗酸染色法与离心涂片法检测结果比较

2.3 预后 根据患儿的年龄、体质量、身体状况、病情严重程度及肝、肾功能，给予HRZ/HRZS方案抗结核治疗，同时应用糖皮质激素减少炎性渗出、甘露醇降颅压等对症治疗，30例患者中有25例好转，好转率为83.3%;3例因病情危重放弃治疗;另2例治疗无效死亡，离心涂片阳性的患者最早死亡。出院1年后随访，放弃治疗3例均死亡，总病死率为16.7%。

3 讨论

随着结核病疫情的回升，成人结核病的增加引起儿童结核病增多现象十分明显。我国第四次结核流行病学抽样调查显示0～14岁儿童结核感染率为9%，感染人数约为2608.1万［8］。儿童结脑在小儿结核病中最为严重，由于儿童免疫力低，结脑症状特异性差，诊断困难，易误诊误治，造成不良后果甚至死亡。儿童结脑的早期诊断十分重要，如能早期诊断及合理治疗，则可降低致残率和病死率［9］。目前，临床医生主要以CSF培养、抗酸染色、免疫学、PCR、常规和生化等检测结果作为结核菌感染的诊断指标，其中病原学检查是诊断的“金标准”，其常用方法是培养法和离心涂片抗酸染色镜检法。

结核菌培养常采用改良罗氏培养法，一般需要4～8周，培养周期长，不利于早期诊断，BACTEC MGIT 960培养法虽较改良罗氏培养法快速，但也在1个月左右，由于脑脊液中结核菌数量极小，此法的检出时间未见明显缩短。离心涂片抗酸染色镜检法虽然简便、经济、设备要求低，但是其检出限位5000～10 000条/mL结核菌才能被检出，检出率极低，一般在0～10%。脑脊液中结核菌有两个特点，数量极少、密度小于水的密度，以致难以通过离心完全沉淀。上述两种方法都用到了离心的步骤，此步骤目的是浓集结核菌，但是在此过程中造成了本来就数量极少的结核菌的进一步丢失，其主要原因有:①结核菌密度小，在静置情况下往上漂浮，很难通过离心使结核菌完全沉淀到管底，在弃掉上清时引起丢失。②巨大离心力使得本来量就很少的结核菌紧紧地贴在管壁，很难完全吹打下来，在转移的过程中造成丢失。③在抗酸染色的过程中，需要几次水洗，部分结核菌会掉下来。改良抗酸染色法应用了Cytospin玻片离心沉淀仪，它有效地克服了离心过程的缺点，在甩片过程中，液体成分被滤纸吸收，结核菌直接沉淀在玻片上，没有弃上清和转移损失的问题，有形成分沉淀面积(直径6 mm)远远小于涂片法，实现了浓集的目的。改良抗酸染色法设备较简单，价格低，一份标本检测时间只需30 min。本研究中，此法较BACTEC MGIT 960培养法和离心涂片法具有明显的差异性。

综上所述，改良抗酸染色法快速、简便、高效、经济、便捷、诊断儿童结脑阳性率高，有助于早期诊断，值得临床推广应用。

［1］冯玉麟，刘之荣，张尚福，等.结核性脑膜炎129例的临床与病理［J］.中华结核与呼吸杂志，1997，20(3):161 －163.

［2］Murakami S，Takeno M，Oka H，et al.Diagnosis of tuberculous meningitis due to detection of ESAT-6-specificgamma interferon production in cerebrospinal fluid enzyme-linked immunospot assay［J］.Clin Vaccine Immunol，2008，15(5):897 －899.

［3］Mathai A，Radhakrishnan VV，Georqe SM.A newer approach for the laboratory diagnosis of tuberculous meningitis［J］.Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2001，39(4):225 －228.

［4］Chen P，Shi M，Feng GD，et al.Highly efficient Ziehl-Neelsen stain:identifying de novo intracellular mycobacterium tuberculosis and improving detection of extracellular M.tuberculosis in cerebrospinal fluid［J］.J Clin Microbiol，2012，50(4):1166 －1170.

［5］Feng GD，Shi M，Ma L，et al.Diagnostic Accuracy of Intracellular Mycobacterium tuberculosis Detection for Tuberculous Meningitis［J］.Am J Respir Crit Care Med，2014，189(4):475 －481.

［6］赵钢，杜芳.结核性脑膜炎临床诊断思路［J］.中国现代神经疾病杂志，2013，13(1):1 －4.

［7］中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程［J］.中国防痨杂志，1996，18(2):80 －85.

［8］全国结核病流行病学抽样调查办公室.2000年全国结核病流行病学抽样调查报告［J］.中国防痨杂志，2002，24(2):65－86.

［9］范永琛.儿童结核性脑膜炎的早期诊断和鉴别［J］.中华医学杂志，2004，84(20):1743 －1744.