环氧化酶1、P2Y1、GPⅠa及GPⅢa基因多态性与阿司匹林抵抗的相关性研究

王 林,黄永高,张意仲,汤永华,赵小飞



·短篇论著·

环氧化酶1、P2Y1、GPⅠa及GPⅢa基因多态性与阿司匹林抵抗的相关性研究

王 林,黄永高,张意仲,汤永华,赵小飞

目的 探讨环氧化酶1(COX-1)(A842G、C50T)、P2Y1(A1622G、C893T)、GPⅠa(C807T、 G873A)及GPⅢa(T1565C)4个基因中7个位点的多态性与阿司匹林(ASP)抵抗(AR)的相关性。方法 选取2011年10月—2013年12月武警浙江省总队杭州医院内科住院的动脉粥样硬化患者243例，测定患者血小板聚集(PA)率，并将患者分为AR组，ASP半抵抗(ASR)组，ASP敏感(AS)组。测定各组COX-1、P2Y1、GPⅠa及GPⅢa基因型。比较3组患者一般资料及COX-1、P2Y1、GPⅠa、GPⅢa基因多态性。结果 AR组28例，ASR组71例，AS组144例。3组患者的年龄、性别、吸烟率、高血压发生率、总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。3组患者糖尿病发生率比较，差异有统计学意义(P<0.01)；AS组患者糖尿病发生率低于AR组(P<0.05)。3组间COX-1(842 A>G)、COX-1(50 C>T)、P2Y1(1622 A>G)、GPⅠa(873 G>A)、GPⅢa(1565 T>C)频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。3组间P2Y1(893 C>T)和GPⅠa(807 C>T)频率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；AR组和ASR组P2Y1(893 C>T)、GPⅠa(807 C>T)频率高于AS组(P<0.01)。结论 P2Y1 (C893T)、GPⅠa (C807T)等位基因的变异与AR具有一定程度的关联，为指导临床用药提供了参考依据。

多态性,单核苷酸；阿司匹林抵抗；血小板聚集

王林,黄永高,张意仲,等.环氧化酶1、P2Y1、GPⅠa及GPⅢa基因多态性与阿司匹林抵抗的相关性研究[J].中国全科医学，2015，18(15)：1832-1835.[www.chinagp.net]

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表1 基因扩增引物及长度

药物遗传学主要是研究不同个体遗传因素对于药物代谢和药物反应的影响，药物遗传多态性表现为药物代谢酶、药物转运蛋白以及药物作用靶点的多态性。目前，中国人群中慢性疾病遗传机制和药物治疗的有效性及安全性研究已经成为我国医学领域的重点课题之一。心血管疾病已经成为影响人类健康的最大杀手，阿司匹林(aspirin，ASP)则是治疗缺血性心脑血管疾病的基石，基因变异可能是患者对ASP敏感性下降的重要原因[1-3]。本研究选取4个基因的7个多态性位点环氧化酶1(COX-1)(A842G、C50T)、P2Y1(A1622G、C893T)、GPⅠa(C807T、G873A)、GPⅢa(T1565C)，以探讨基因多态性与ASP抵抗(aspirin resistance，AR)的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2011年10月—2013年12月武警浙江省总队杭州医院内科住院的动脉粥样硬化患者243例，均服用ASP 100 mg/d，服药时间>14 d。其中男184例，女59例；年龄48～92岁，平均(69.8±14.3)岁；合并高血压136例、糖尿病69例、冠心病33例；既往脑梗死病史87例、高脂血症病史66例。排除标准：(1)患有急慢性血液系统疾病者；(2)入选前3周内应用ASP剂量≥100 mg/d，或服用除ASP外其他抗血小板或对血小板功能有影响的药物者；(3)有严重肝、肾功能损害者。本研究经过本院伦理委员会批准并在患者签字同意的情况下进行。

1.2 研究方法

1.2.1 测定血小板聚集(PA)率 清晨采集空腹前臂静脉血5 ml,将枸橼酸钠抗凝标本在室温下200×g离心10 min，制备富含血小板血浆(PRP),移去PRP加盖静置，剩余标本在室温下1 600×g离心10 min，制备贫血小板血浆(PPP)，测得5 min内PA率最大值。利用光学法PA检测血小板的功能。根据徐旭等[4]提出的AR判断标准：(1)0.5 mmol/L花生四烯酸(AA)作为诱导剂，PA率≥20%；(2)10 μmol/L二磷酸腺苷(ADP)作为诱导剂，PA率≥70%。符合上述2项，为AR；符合1项者为ASP半抵抗(ASR)；2项均不符合为ASP敏感(AS)。按以上条件将患者分为AR组、ASR组及AS组。

1.2.2 单核苷酸多态性(SNP)分析 利用QIAGEN公司提供的基因组DNA提取试剂盒提取血液标本中的基因组DNA，并利用Thermo Fisher Scientific公司生产的NanoDrop2000cUV-Vis分光光度计进行基因纯度和定量鉴定。利用PRIME 5.0软件设计COX-1、P2Y1、GPⅠa及GPⅢa基因扩增的上、下游引物(见表1)。根据片段长度设置合适的扩增时间和退火温度，94 ℃变性1 min，45～60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共40个循环，最后一循环后4 ℃保存。PCR产物经琼脂糖电泳分离纯化后，送上海桑尼生物科技有限公司测序分析。

1.2.3 基因多态性检测方法 COX-1、P2Y1、GPⅠa及GPⅢa基因中7个位点〔COX-1(A842G、C50T)、P2Y1(A1622G、C893T)〕、GPⅠa(C807T、G873A)、GPⅢa(T1565C)的多态性由SNP Analysis软件直接读出。

1.3 观察指标 比较3组患者一般资料及COX-1、P2Y1、GPⅠa、GPⅢa基因多态性。

2 结果

2.1 3组患者一般资料比较 AR组28例，ASR组71例，AS组144例。3组患者的年龄、性别、吸烟率、高血压发生率、总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2、3)。3组患者糖尿病发生率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；AS组患者糖尿病发生率低于AR组，差异有统计学意义(P<0.01，见表3)。

2.2 基因多态性位点等位基因分布频率 243例患者中COX-1(A842G、C50T)、P2Y1(A1622G、C893T)、GPⅠa(C807T、 G873A)及GPⅢa(T1565C)4个基因中7个多态性位点的等位基因分布频率见表4。

2.3 3组间COX-1、P2Y1、GPⅠa及GPⅢa基因多态性比较 3组间COX-1(842 A>G)、COX-1(50 C>T)、P2Y1(1622 A>G)、GPⅠa(873 G>A)、GPⅢa(1565 T>C)频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。3组间P2Y1(893 C>T)和GPⅠa(807 C>T)频率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；AR组和ASR组P2Y1(893 C>T)、GPⅠa(807 C>T)频率高于AS组，差异有统计学意义(P<0.01，见表5)。

表2 3组患者一般资料比较±s)

注：AR=阿司匹林抵抗，ASR=阿司匹林半抵抗，AS=阿司匹林敏感

表3 3组患者一般资料比较〔n(%)〕

注：与AR组比较，*P<0.01

表5 3组间COX-1、GPⅠa、GPⅢa及P2Y1基因多态性比较〔n(%)〕

注：与AS组比较，*P<0.01

表4 基因多态性位点等位基因分布频率(%)

Table 4 The distribution of gene polymorphism alleles

基因多态性位点野生型等位基因及频率突变型等位基因及频率COX-1(842A>G)A448/486(922)G38/486(78)COX-1(50C>T)C456/486(938)T30/486(62)P2Y1(1622A>G)A441/486(907)G45/486(93)P2Y1(893C>T)C452/486(930)T34/486(70)GPⅠa(807C>T)C446/486(918)T40/486(82)GPⅠa(873G>A)G450/486(926)A36/486(74)GPⅢa(1565T>C)T454/486(934)C32/486(66)

3 讨论

心脑血管疾病是目前威胁我国国民健康的头号杀手，每年约有300万人死于心血管疾病，约占死亡人口的1/3。ASP是目前治疗心血管疾病公认的有效药物[4]，然而并非所有患者能从中受益。临床实践证明，部分患者对ASP的心血管保护作用反应较差，即存在AR影响[3]。目前，越来越多的学者开始重视这一问题，但是对于AR的机制尚不清楚，可能与剂量和依从性、血小管旁路激活途径和基因多态性相关。所有这些因素使机体对ASP的敏感性降低[5]。因此，研究基因多态性与AR发生的关系对于最终理解AR的机制具有重要的意义。

多项研究表明，遗传因素在AR发生过程中起到重要作用，Faraday等[6]的研究进一步揭示，基因多态性及基因之间的相互作用能影响血小板对ASP治疗的反应。COX-1基因位点在本研究的患者中尽管发现多态性，但经过分析发现，其在AR组/ASR组中的携带率与AS组患者的携带率并无差异。这些位点的突变均为同义突变，因此对蛋白表达并不产生影响[7-8]，这可能是其与AR无关联性的原因。

血小板GPⅠa/Ⅱa 复合物为胶原最初的受体，在血小板与受损血管病的黏附与聚集中发挥重要作用。研究显示，807T等位基因与血小板膜上的GPⅠa/Ⅱa受体密度的增加显著相关。受体密度不同，则血小板黏附于胶原的速度也不同，这表明一种潜在的血栓形成危险因子可能在AR的发生中起到促进作用。Moshfegh 等[9]研究发现，807T/873A 等位基因纯合子与急性心肌梗死的发生相关。大量研究提示，807T 等位基因与心肌梗死、脑梗死等血栓事件具有相关性[10-11]。本研究发现，GPⅠa C807T 位点上，AR组及ASR组的T等位基因频率高于AS组。说明ASP对于这类患者可能失效，并且其原因可能与血栓形成等因素有关。

GPⅢa与GPⅡb以非共价键结合构成二聚体复合物，作为血小板膜上纤维蛋白原受体。GPⅡb/Ⅲa活化并与纤维蛋白原结合是引起PA的最终共同途径。GPPⅢa聚乳酸(PLA)具有多态性，最常见的2个变型为亮氨酸(PLA1)、脯氨酸(PLA2)。GPPⅢa基因第2个外显子核苷酸第1565位T被C所取代，使编码的第33位PLA1被PLA2所取代[12]。这可能导致GPⅡb/Ⅲa受体结构重要构相改变，从而导致PA异常。

ADP受体P2Y1基因的相应功能变化能够改变ADP的信号功能[13-14]，降低对ASP的反应性，从而导致血栓事件的产生[15-16]。本研究发现，P2Y1 C893T位点上，AR组及ASR组T等位基因频率高于AS组，提示P2Y1基因第893位点发生由T取代C后，变异导致带有突变等位基因的患者AR极大增加，而P2Y1基因第1622位点中G取代A变异，并未对患者的AR造成显著影响。

综上所述，P2Y1(C893T)、GPⅠa(C807T)等位基因与AR相关，可能是遗传易患因素。因此，对于存在上述变异的患者，其最终发生AR的可能性较野生型患者更高，临床上开展个体化的SNP检测，对于进一步指导用药治疗具有重要价值。但本研究样本量较少，干扰因素较多，因此还需做进一步研究证明。

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修回日期：2015-03-13)

(本文编辑：李婷婷)

Correlation Between Aspirin Resistance and Gene Polymorphisms of COX-1,P2Y1,GPⅠa and GPⅢa

WANGLin，HUANGYong-gao，ZHANGYi-zhong，etal.

DepartmentofPharmacy,ZhejiangArmedPoliceCorpsHangzhouHospital，Hangzhou310051，China

Objective To investigate the correlation between polymorphisms of 7 sites in 4 genes COX-1 (A842G,C50T),P2Y1 (A1622G,C893T),GPⅠa (C807T,G873A) and GPⅢa (T1565C) and aspirin resistance (AR).Methods A total of 243 patients with atherosclerosis who were admitted to Department of Internal Medicine in Zhejiang Armed Police Corps Hangzhou Hospital during October 2011 to December 2013,were selected as study subjects,the platelet agglutination rate was detected,patients were divided into three groups:aspirin resistant (AR) group,aspirin semi-responder (ASR) group and aspirin sensitive (AS) group,genotype of COX-1,P2Y1,GPⅠa and GPⅢa was analyzed respectively.The general informations and gene polymorphisms of COX-1,P2Y1,GPⅠa,GPⅢa were compared among three groups of patients.Results AR group,ASR group and AS group included 28 cases,71 cases and 144 cases,respectively.There was no significant difference in age,gender,smoking rate,hypertension prevalence,total cholesterol level,triacylglycerol level and low density lipoprotein level among three groups of patients (P>0.05).There was significant difference in prevalence of diabetes mellitus among three groups of patients (P<0.01).Prevalence of diabetes mellitus of patients in AS group was significantly lower than that of patients in AR group (P<0.05).There was no significant difference in frequency of COX-1 (842 A>G),COX-1 (50 C>T),P2Y1(1622 A>G)，GPⅠa (873 G>A) and GPⅢa (1565 T>C) among three groups (P>0.05).There were significant differences in frequency of P2Y1(893 C>T) and GPⅠa (807 C>T) among three groups (P<0.05),and the frequency of P2Y1(893 C>T) and GPⅠa (807 C>T) in AR group and ASR group was significantly higher than that in AS group,respectively (P<0.01).Conclusion There are correlations between mutation of P2Y1(C893T),GPⅠa (C807T)alleles and aspirin resistance,which provides a reference for guiding the clinical medication.

Polymorphism,single nucleotide；Aspirin resistance；Platelet aggregation

310051浙江省杭州市，武警浙江省总队杭州医院药剂科

王林，310051浙江省杭州市，武警浙江省总队杭州医院药剂科；E-mail：wlwl182036@163.com

R 972

B

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.15.021

2014-12-21；