应用16S rDNA全序列测序技术鉴定生鲜乳中的细菌种类

韩瑞芳,董晓敏,刘天明

(齐鲁工业大学食品科学与工程学院,山东省微生物工程重点实验室 山东济南 250353)

应用16S rDNA全序列测序技术鉴定生鲜乳中的细菌种类

韩瑞芳,董晓敏,刘天明*

(齐鲁工业大学食品科学与工程学院,山东省微生物工程重点实验室 山东济南 250353)

采用玻璃珠法提取生鲜乳中分离的34株细菌基因组DNA,用细菌通用引物(27f/1492r)PCR扩增16S rDNA片段并测序,与GenBank数据库同源序列比对,系统发育树聚类分析,并结合形态学和生理学特征确定了34株菌的种属地位。结果表明,共鉴定出16个种属。3个生鲜乳样中细菌种类及其分布特点不同。其中1号样有7种细菌,以Acinetobactersp.(不动杆菌属)为主,2号样有6种细菌,以Klebsiellasp.(克雷贝氏杆菌属)为主,3号样有6种细菌,分布较为分散。从致病性来看,分离菌株主要为条件致病菌或腐败菌,无烈性致病菌。

生鲜乳,16S rRNA,细菌,鉴定

生鲜乳含有丰富的人体必需营养物质,常被作为各类乳品的加工原料或辅料。但生鲜乳在加工前的采、贮、运过程中易受到环境中各种微生物污染,极易引发食品安全事件。生鲜乳的卫生监控和微生物检验是保证乳品食用安全的第一道关口,对乳制品加工质量意义重大[1],因此,生鲜乳中微生物的群落结构及其生物多样性的研究对食源性致病菌及其毒素的预防[2]具有指导意义。细菌鉴定主要有表型特征鉴定和基因型鉴定2种方法。传统上对牛乳中微生物多样性及其种类鉴定的方法一般采用表型特征鉴定,但此法存在操作步骤繁琐、工作量大、周期长、某些检测结果不稳定等问题[3]。目前PCR技术、基因芯片、流式细胞技术等被广泛用于乳品微生物的检测和鉴定[4]。

核酸序列分析技术已经用于多种微生物的鉴定和系统发育分类[5],其中16S rDNA序列常被用于细菌鉴定[6]。Woese[7]及Olsen[8]基于16S rDNA的分析构建了全生命系统进化树,该技术在微生物分类鉴定以及分子检测中得到了广泛应用,越来越多的细菌依据16S rDNA被精准鉴别或重新分类。该法操作简便、快速、准确且灵敏,已被广泛应用于医疗、食品行业致病菌种类鉴定、系统发育及种群多样性的研究[9-10]。

本研究以采自3家奶牛场的生鲜牛乳中分离得到的37株细菌为材料,玻璃珠法提取基因组DNA,用细菌通用引物(27f/1492r)PCR扩增16S rDNA,经与GenBank数据库模式株序列进行同源比对分析,并构建系统发育树,结合形态学和生理学特征对受试菌株分类,查明生鲜乳中微生物的种类和分布特点。

表1 部分代表性菌株的形态特征

注:
注:表中的代表性菌株形态特征包含34株菌株的所有形态类型。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生鲜乳样品取自3家奶牛养殖场(样品编号为A、B、C),取样容器使用前已灭菌,常规无菌操作,奶样置于4 ℃冷藏备用。

细菌16S rDNA通用引物为27f(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492r(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)[11]。主要分子试剂购自上海生工生物公司。

E2000型光学显微镜 日本Nikon;DYY-12型电泳仪 北京六一;TC-XP型PCR扩增仪 杭州博日;TGL-16M型高速冷冻离心机 上海安亭;SX-300型凝胶成像系统 上海四星生物,等。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的分离及形态学观察 取1 mL生鲜乳用9 mL无菌生理盐水进行10倍梯度稀释。根据预实验结果选取三个适宜稀释度的菌液200 μL分别涂布于LB固体平板上,每一稀释度做三个平行,置于37 ℃培养箱中培养24～48 h。待菌落长成后,挑取单菌落划线纯化多次,直至获得纯培养物,并编号保藏于4 ℃冰箱。观察各菌株的平板菌落特征[12],以及在显微镜下菌体形态和染色特征,归类分析。选取各类代表菌株供鉴定用。

1.2.2 基因组DNA的提取 玻璃珠法:参照王红等[13]的方法提取供试菌株的基因组DNA。取过夜培养的菌液于EP管中,8000 r/min,离心1 min,弃上清;200 μL的TE重悬,离心弃上清;200 μL的破壁缓冲液重悬,将其转移至含有玻璃珠的EP管中,再向其加入200 μL的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1,v/v),高速震荡3 min;加入200 μL TE静置5 min,4℃下10000 r/min离心10 min,将上层水相转至另一EP管中;加入上层水相两倍体积的预冷无水乙醇,再加入0.1倍体积的5 mol/L KAC溶液,轻轻混匀,-20 ℃放置20 min;12000 r/min,4 ℃离心10 min,弃上清,晾干,沉淀用200 μL TE缓冲液溶解;加入1 μL的RNA酶(20 mg/mL),和1 μL的蛋白酶K(20 mg/mL),各37 ℃水浴30 min;加入0.1倍体积的4 mol/L NH4AC及等体积的异丙醇,混匀后-20 ℃放置20 min,10000 r/min,离心10 min,弃上清;用预冷的70%乙醇200 μL洗涤两次弃上清,晾干;用30 μL的TE溶解,将其置于-20 ℃保存备用。

采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和含量。

1.3 细菌16S rDNA的PCR扩增

细菌16S rDNA PCR扩增体系为50 μL。扩增程序为:95 ℃预变性5 min,(94 ℃变性30 s,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸90 s)×36个循环,72 ℃延伸10 min[14]。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物纯化后送至华大基因公司测序,并将所测34株菌株的16S rDNA序列提交GenBank库(序列号列于表2)。

2 结果与分析

2.1 菌株细胞形态特征

受试菌株中7株为G+菌,27株为G-菌,菌落主要为乳白色,少数灰色和黄色,细胞形态主要呈杆状、长杆状,少数为球状。

2.2 细菌基因组DNA的提取和PCR产物检测

以玻璃珠法提取受试菌株基因组DNA,纯度和浓度符合要求。PCR扩增产物中检测到约1.5 kb左右DNA特异目标带,纯化后完成测序。

图1 16株细菌基因组DNA电泳图Fig.1 The electrophoresis figure ofgenome DNA extracted from 16 bacterial strains注:M-DL2000maker,1～16为16株不同的细菌菌株,图2同。

图2 16株细菌的16Sr DNA的PCR产物电泳图Fig.2 The electrophoresis figure of16Sr DNA PCR amplification of 16 bacterial strains

2.3 16S rDNA序列测定及系统发育学地位的确定

受试菌株中有34株获得16S rDNA完整序列,与GenBank数据库模式菌株比对分析,所有菌株碱基同源比率在98%～100%之间。用DNA分析软件Clustalx(1. 8)进行多重序列比较[15],用MEGA4软件中Neighbor-Joining方法完成分子系统学分析[16],同时进行1000次bootstrap统计学检验[17],构建系统发育树展示细菌的遗传多样性和菌株间的亲缘关系。系统发育树展示菌株之间的亲缘关系,其中13株鉴定到种,其余21株鉴定到属,再结合形态特征确定了各细菌在微生物系统发育学上的地位(见图3)。

由表3可见,3个生鲜乳样中细菌种类数及其分布特点不同。其中1号样至少有7种细菌,以Acinetobactersp.(不动杆菌属)为主,2号样至少有6种细菌,以Klebsiellasp.(克雷贝氏杆菌属)为主,3号样含有6种细菌且分布较为分散。通过对34株菌株的形态学观察,这34株菌的形态均与《伯杰细菌鉴定手册》第八版中的描述特征一致[12]。从致病性来看,分离菌株为条件致病菌或腐败菌。奶样中微生物种类特点是奶源地生境和奶牛健康状况的反映。奶牛场中生鲜乳的细菌污染来源是多样的。奶牛身体状况、养殖场周边环境卫生状况、采乳用具及操作细节等是防范牛乳污染的重要方面。

表3 3个采样点细菌的分布特点

3 讨论与结论

通过对实验结果分析发现,1号奶样主要菌种为肠杆菌属(Enterobactersp.)、不动杆菌属(Acinetobactersp.),2号奶样菌种主要为克雷白氏杆菌属(Klebsiellasp.),3号采样点的菌种分布不集中。奶牛厂中生鲜乳的细菌污染来源和差异性原因是多样的。本本文涉及的3个采样点属于同一地区的不同养殖场,地理位置和气候条件相近,不同之处在于奶牛饲养场小环境和卫生管理水平。1号样来自农户,规模较小卫生管理差,2和3号来自现代化标准奶牛场,小环境卫生较好,挤奶操作规范。因此,各样点细菌差异可能与奶场环境卫生管理相关。

采用16S rDNA序列分析鉴定奶源细菌种类方法可分为培养法和免培养法。由于某些难养菌通过纯培养不易培养成功,本文用培养方法很难全面反映生鲜乳中微生物的多样性[18]。从理论上讲,免培养法可以更真实反映奶样中微生物的种类和群体数量。本研究曾采用免培养法多次直接从奶中提取宏基因组DNA,并PCR扩增获得16S rDNA序列,构建生鲜乳中细菌微型16S rDNA基因文库,至今未获得理想效果。主要原因是:鲜奶中含有丰富蛋白质和油脂,DNA提取和PCR扩增难度增加;另外优质奶源中微生物数量极少,不易获得痕量宏基因组DNA;还有PCR产物与T载体连接效率低下,很少获得重组子。肠杆菌属(Enterobactersp.)、不动杆菌属(Acinetobactersp.)、克雷白氏杆菌属(Klebsiellasp.)等属内受试的各菌株间生理生化和毒力差异正在甄别中。对生鲜乳中细菌多样性的研究,可有效防范肉毒梭菌等烈性致病菌及其毒素的危害,避免问题奶源进入加工工序,可从源头控制奶的质量安全。

图3 基于生鲜乳中34株细菌和相关菌株的16S rDNA序列建立的系统发育树Fig.3 The phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of 34 bacterial strains from raw milk and related strains注:建树采用临位相连法并进行1000次bootstrap统计学检验。

表2 34株细菌16S rDNA序列及其相似模式菌株序列

本文比较分析了生鲜乳中细菌的多样性,对生鲜乳的及时灭菌处理和低温贮存提供了理论依据,同时也为生鲜乳的后续加工工艺及其制品的安全评价提供了理论依据。

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Identification of bacterial species from raw milk by 16S rDNA sequencing

HAN Rui-fang,DONG Xiao-min,LIU Tian-ming*

(College of Food Science and Engineering of Qilu University of Technology,Shandong Province Key Laboratory of Microbial Engineering,Ji’nan 250353,China)

Using glass bead method to extract the genomic DNA of 34 bacterial strains which were isolated and purified in raw milk. Common primer 27f/1492r was used to amplify 16S rDNA fragments. The PCR products were sequenced. Then the 16S rRNA sequences were compared with GenBank database homologous sequence and the phylogenetic tree was constructed through clustering analysis. The phylogenetic status of 34 species of bacteria were determined combined with morphological and physiological characteristics. The results showed that 16 kinds of species were identified. Bacterial species and its distribution characteristics were different among three raw milk samples,where the 1st sample had 7 kinds of bacteria,mainlyAcinetobactersp;the 2nd sample had 6 species,mostlyKlebsiellasp.;the 3rd sample had 6 species of bacteria,the distribution was more dispersed. From the pathogenic point of view,all strains were opportunistic pathogens or spoilage,no virulent pathogens.

raw milk;16S rRNA;bacteria;identification

2014-10-23

韩瑞芳(1990-)，女，硕士，研究方向：食品生物技术,E-mail:HanRuifang1990@163.com。

*通讯作者:刘天明(1961-)，男，博士，教授，主要从事食品微生物技术方面的研究, E-mail:liutm2008@163.com。

国家科技支撑项目(2011BAC11B05)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)15-0152-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.024