4-氯苯氧乙酸钠对绿豆芽生长的影响及其残留分析

杨 婕,黄少文,孙远明,冯文颍,何乐谦,黄志光,柳春红,2,*

(1.华南农业大学食品学院,广东广州 510642;2.农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室,广东广州 510642)

4-氯苯氧乙酸钠对绿豆芽生长的影响及其残留分析

杨 婕1,黄少文1,孙远明1,冯文颍1,何乐谦1,黄志光1,柳春红1,2,*

(1.华南农业大学食品学院,广东广州 510642;2.农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室,广东广州 510642)

探索4-氯苯氧乙酸钠对绿豆芽生长的影响,并检测分析绿豆芽中的4-氯苯氧乙酸钠的动态残留。分别用0.5、1、2、4 mg/L四个浓度的4-氯苯氧乙酸钠溶液,通过浸泡法(方法1)和浸泡喷洒法(方法2)处理绿豆,发制豆芽。豆芽采收后通过测定其鲜重、轴长、轴径、根长、发芽率和产率选出较适宜的培育方法,并测定其培育的绿豆芽中4-氯苯氧乙酸钠的动态残留及市场上采集的32个样品中残留。结果提示,浸泡法中,4-氯苯氧乙酸钠浓度为1 mg/L时,产率最高(7.12)。浸泡喷洒法中,除4 mg/L组出现抑制外,其余各处理组与对照组生长情况相近,无明显促进生长作用。浸泡法中,各处理组豆芽,随着培育时间的增长残留明显降低,在最后采收时,均未检出4-氯苯氧乙酸钠。市场上32个样品中有3个样品中的4-氯苯氧乙酸钠含量在1.39～3.39 mg/kg之间,检出率为9.4%。适宜浓度的4-氯苯氧乙酸钠对豆芽生长有促进作用,综合考虑浸泡法更适宜豆芽的培育,在豆芽培育的过程中4-氯苯氧乙酸钠可逐渐降解,各处理组豆芽具有较高的安全性。

4-氯苯氧乙酸钠,绿豆芽,产率,动态残留

豆芽是由绿豆或黄豆发育而来,同时也是深受广大消费者喜爱的蔬菜之一,含有7种人体所必须的氨基酸,还有大量的蛋白质及多种维生素、膳食纤维等对人体有益成分,而且脂肪、胆固醇含量很低,适合“三高”人群食用,有利于调节不健康的膳食结构[1-5]。另外,豆芽中含有大量的抗酸性物质,能起到有效的排毒作用[6]。4-氯苯氧乙酸钠,又称防落素,是一种内吸、广谱、高效、多功能植物生长调节剂,由植物的根、茎、叶、花和果吸收,主要用于防止落花、落果,抑制豆类生根等,并且可调节植物株内激素的平衡,刺激子房膨大,补充植物体内生长素不足[7]。在豆芽生产中,4-氯苯氧乙酸钠可以促进豆芽下胚轴粗大,减少根部萌发,加速细胞分裂。它作为2、4-二氯苯氧乙酸的替代药物出现在市场中,克服了2、4-二氯苯氧乙酸用药浓度不好控制,易出现畸形等副作用,且累积毒性较小,逐渐在市场上占据了较大的份额[8-11]。据研究,它对大鼠(wistar)无明显致畸作用,但达到一定剂量,可显示某些胚胎毒作用[12-13]。卫生部监督函[2011]919号公告明确指出:4-氯苯氧乙酸钠因缺乏食品添加剂工艺必要性,不得作为食品用加工助剂生产经营和使用[14]。但在一些国家4-氯苯氧乙酸钠可以用于食品生产过程中并对其残留进行相关规定,日本规定其残留限量为0.02 mg/kg,美国、韩国、加拿大均为0.05 mg/kg[7]。故4-氯苯氧乙酸钠在国内外食品生产上应用的相关规定并不一致。现今关于豆芽中4-氯苯氧乙酸钠残留检测方法的研究较多[15-19],但对豆芽生长过程的模拟的相关研究较少。本实验对豆芽农贸批发市场和集贸市场进行调研,并依据市场生产经验总结出两种常用的豆芽培育方式,浸泡法:豆子在营养液(含有4-氯苯氧乙酸钠)中进行浸泡后,在培育过程中喷洒水让其自由生长;浸泡喷洒法:豆子在营养液(含有4-氯苯氧乙酸钠)中进行浸泡后,在培育过程中喷洒水及适当次数的营养液(含有4-氯苯氧乙酸钠)。在此调研结果的基础上,通过实验室模拟实验,观察探讨不同浓度的4-氯苯氧乙酸钠在两种培育方法下对豆芽生长情况的影响,并对较适宜的方法所培育出的豆芽中4-氯苯氧乙酸钠的残留进行动态检测分析,为提出安全替代技术、方法或合理使用添加剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿豆;4-氯苯氧乙酸钠(纯度>98%) Sigma公司;4-氯苯氧乙酸(HPLC级、纯度>99%) 阿拉丁公司;磷酸二氢钠(分析纯)、盐酸(1 mol/L) 广州化学试剂厂;氯化钠固体(分析级) 国药集团化学试剂有限公司;乙腈(分析纯) 天津大茂化学试剂厂;甲醇(色谱纯) 美国Honeywell公司;乙二胺基-N-丙基(PSA) Agilent公司。

豆芽机 购于广东小熊电器有限公司;岛津L-20高效液相色谱仪 购于日本岛津公司;离心机;天平;超声机;微孔滤膜:0.22 μm。

1.2 豆芽的培养

本研究共设四个处理组和一个空白对照组,每组精选500颗粒仔饱满的供试绿豆。

浸泡法(方法1):以豆子∶营养液=1∶2的比例浸泡豆子5 h,转移到盛有水的豆芽机中培育。控制培育温度范围为:23～28℃,前5个小时内隔5 min喷水1次;5小时之后隔1 h喷水1次,喷淋时间为1 min,避光培育。对照组和四个处理组营养液中4-氯苯氧乙酸钠浓度分别为:0、0.5、1、2、4 mg/L。

浸泡喷洒法(方法2):以豆子∶营养液=1∶2的比例浸泡豆子5 h,转移到盛有水的豆芽机中培育。控制培育温度范围为:23～28℃,前5 h内隔5 min喷水1次;5 h之后隔1 h喷水1次,喷淋时间为1 min,早晚各喷淋对应浓度的营养液1次,避光培育。对照组和四个处理组营养液中4-氯苯氧乙酸钠浓度分别为:0、0.5、1、2、4 mg/L。

1.3 豆芽的生长指标测定

发芽后的豆芽,取30根豆芽,去根，测其30根鲜重(g),并用游标卡尺进行轴长、轴径、根长的测量;胚根露出种皮超过豆子长度1 cm以上即为发芽,发芽率计算详见下述公式;豆芽产率以大豆的投入量与豆芽产出量的比值表示[23]。进行5次重复测定取平均值。

鲜重(g/根)=30根鲜重(g)/30根

发芽率(%)=培育结束后发芽豆数/500×100

产率=鲜重(g/根)×最终发芽率(%)×500粒/五百粒豆重(g)。

1.4 绿豆芽中的4-氯苯氧乙酸钠残留动态分析

比较浸泡法与浸泡喷洒法后得出较适宜的培育方式,并按照此方式对豆芽进行培育,分别在第1、2、3、4 d的早上九点取样。

取样方法:本研究设有四个处理组和一个空白对照组,每组都有对应的一台豆芽机,每台豆芽机被分为四个区域:A、B、C、D。每天早上九点,分别在每台豆芽机的A、B、C、D四个区域各取一份样品,即每组四个样品,每个样品的检测重复两次。

1.5 高效液相色谱法测定豆芽中的4-氯苯氧乙酸钠

1.5.1 标准系列制备 准确称取4-氯苯氧乙酸的标准品0.1000 g,置于100 mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,作为1000 μg/mL的标准储备液;取10 mL置于100 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,作为 100 μg/mL标准储备稀释液,分别取0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mL此标准储备稀释液置于100 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,制成0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L的标准品溶液,待色谱分析用。

1.5.2 豆芽样品处理 称取15 g试样(精确到0.01 g)于50 mL离心管中,加入30 mL乙腈,超声震荡提取30 min,以4000 r/min离心5 min,取上清液10 mL,加入1.0 mL盐酸溶液,振摇。加入2.5 g氯化钠,振摇,静置10 min。取1 mL上层提取液于2 mL离心管中,加入50 mg PSA,放入离心机中,以7000 r/min离心5 min。取1 mL上清液过0.22 μm滤膜,用于液相色谱测定[20]。

1.5.3 液相色谱测定 液相色谱参考条件:色谱柱:美国Phenomenex® GeminiTM-C18,4.6 mm×250 mm,5.0 μm;柱温:28 ℃;进样体积:10.0 μL;测定波长:224 nm;流动相:有机相为乙腈,水相为0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液(pH3.0),梯度变化详见表1。

表1 流动相及流速

2 结果与分析

2.1 4-氯苯氧乙酸钠培养对绿豆芽生长的影响

浸泡法所培育的绿豆芽生长状况如表2所示,对于鲜重,只有2 mg/L组与对照组比较有显著性差异;对于轴长,1 mg/L和2 mg/L组与对照组比较有显著性差异,1 mg/L组的最长,其后开始下降;轴径各组间无明显差异;对于根长,随着营养液中4-氯苯氧乙酸钠浓度的增加逐渐变短,并且各处理组均与对照组有显著性差异;各组间的发芽率接近;但产率各处理组均高于对照组。由此可得,4-氯苯氧乙酸钠可适当的增加豆芽的轴长,并且明显的抑制豆芽根部的生长,对绿豆芽的生长有一定的促进作用。总体上,1 mg/L的4-氯苯氧乙酸钠对豆芽的促进作用最大。

表2 浸泡法绿豆芽生长情况

注:
注:“*”表示经t检验,与对照组比较有显著性差异(p<0.05),表3同。

表3 浸泡喷洒法绿豆芽生长情况

浸泡喷洒法所培育的绿豆芽生长状况如表3所示,对于鲜重,各处理组均低于对照组,并且1、2、4 mg/L组与对照组有显著性差异;对于轴长,除0.5 mg/L组略高于对照组以外,其余各组均低于对照组,并且有显著性差异;对于轴径,4 mg/L组明显比其余各组粗,与对照组有显著性差异;对于根长,随着营养液中4-氯苯氧乙酸钠浓度的增加逐渐变短,各处理组均与对照组有显著性差异;各处理组的发芽率均高于对照组;对于产率,4 mg/L组产率最低,其余处理组与对照组产率接近。总体而言,浸泡喷洒法中,4-氯苯氧乙酸钠对豆芽生长的促进作用不明显,并且高浓度出现了抑制。

浸泡法中,1 mg/L组绿豆芽的产率最高;而浸泡喷洒法中各组产率接近,对豆芽的生长的促进作用不明显,并且每日需要喷洒营养液较为麻烦。综合考虑,浸泡法更适宜用于豆芽的培育。

根据研究结果可知,适宜的方法和适宜浓度的4-氯苯氧乙酸钠能使培育的豆芽轴长变长、根长变短,产率增大,对豆芽有促进作用,而高浓度的4-氯苯氧乙酸钠则对豆芽的生长有抑制作用。王一茜[21]分别用浓度为5、10、20、40 mg/L的4-氯苯氧乙酸钠培育绿豆芽发现,空白对照组对豆芽轴长的促进作用更为明显,5 mg/L组豆芽的鲜重最大,40 mg/L组的轴径最粗,但轴长最短,第10 d收获时,仅为4.73 cm。而本研究浸泡法中,轴长最长的为1 mg/L,鲜重最大的为2 mg/L,轴径无明显差别;浸泡喷洒法则对豆芽生长无明显的促进作用,并且4 mg/L组出现抑制。出现不一致的原因可能是因为王一茜[21]在剂量设定时,间距较大,根据其论文结果可知,浓度为20 mg/L和40 mg/L的4-氯苯氧乙酸钠均抑制豆芽生长,而本研究在设定剂量时,间距较小,故本研究结果可以更好地体现在0～5 mg/L这个浓度范围内,4-氯苯氧乙酸钠对绿豆芽生长情况的影响;其次,王一茜[21]用营养液隔夜浸泡豆子后,每日添加10 mL的去离子水培育10 d,与本研究中的两种培育方法有较大差别。4-氯苯氧乙酸钠,又称防落素,是一种内吸、广谱、高效、多功能植物生长调节剂,但在剂量高时具有除草效果[7]。每种植物生长调节剂都有特定的用途,而且应用技术要求相当严格,往往改变浓度就会得到相反的结果,例如在低浓度下有促进作用,而在高浓度下则变成抑制作用[21-24]。本研究中浸泡喷洒法,4 mg/L组出现抑制作用。王一茜[21]高浓度4-氯苯氧乙酸钠组的绿豆芽,虽然其轴径最粗,但轴长最短,也出现抑制作用。可推断其原因可能是高浓度的4-氯苯氧乙酸钠具有除草效果,在高浓度下出现抑制生长的作用。本研究在评价4-氯苯氧乙酸钠对豆芽生长情况的影响时,主要是从其产率方面去考虑,因为鲜重、发芽率以及豆重都会影响到产率,大部分文章在评价一些添加剂对豆芽生长情况的影响时,都只从轴长、轴径亦或是鲜重等单方面去考虑[21-23],但豆子的重量可影响其鲜重,以及浸泡的条件会影响到整体豆子的发芽率,因此,综合考虑得出的结果可能更符合市场需求。

表4 浸泡法培育的绿豆芽4-氯苯氧乙酸钠残留(mg/kg)

注:
注:“-”表示未检出,表5同。

2.2 绿豆芽中的4-氯苯氧乙酸钠的测定

2.2.1 4-氯苯氧乙酸钠检测标准曲线 图1为4-氯苯氧乙酸钠液相色谱标品图,由图可知,其保留时间为14.9 min。

图1 4-氯苯氧乙酸钠标品色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of 4-chorophenxyacetate standard

以4-氯苯氧乙酸钠0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L共5个浓度与相应峰面积作直线回归,绘制标准曲线,见图2。其回归方程为y=13229.05x-1449.74,R2=0.9994,方法检出限(S/N=3)为0.2 mg/kg。

图2 4-氯苯氧乙酸钠标准曲线Fig.2 Standard curve of 4-chorophenxyacetate

2.2.2 自种绿豆芽中4-氯苯氧乙酸钠含量的检测 两种方法所培育的成熟绿豆芽样品(对照组和4个处理组)上机检测,均未检出4-氯苯氧乙酸钠。

根据2.1结果可知,浸泡法更适宜用于绿豆芽培育,因此,对其绿豆芽中的4-氯苯氧乙酸钠残留进行动态分析。结果如表4所示。

由表4可知,随着时间延长,绿豆芽中的4-氯苯氧乙酸钠残留量逐渐下降,0.5 mg/L组在第3 d开始未检出,各组在最后一天采收豆芽时,均未检测出4-氯苯氧乙酸钠。

研究发现,利用5 mg/L的4-氯苯氧乙酸钠培育绿豆芽,每日残留量呈显著性下降趋势,在第7 d采收时,绿豆芽中4-氯苯氧乙酸钠的残留量仅为0.002 mg/kg[25]。这与本实验结果的趋势是一致的。这表明在豆芽生长过程中,4-氯苯氧乙酸钠被豆芽吸收后可能发生了降解,而随着豆芽培育时间的增长,不断淋洗豆芽,残留量亦会大大降低。本研究中,最后一天所采收的绿豆芽均未检出4-氯苯氧乙酸钠残留,可能是因为豆芽中4-氯苯氧乙酸钠的含量极少,在检出限以下,无法测出,因此在以后的研究中,一方面有必要对4-氯苯氧乙酸钠的检测方法进一步优化,另一方面也需要对4-氯苯氧乙酸钠的降解及转归开展研究。

若以0.2 mg/kg作为本研究所培养绿豆芽中4-氯苯氧乙酸钠的最高残留水平,假设体重为60 kg的个体按照平衡膳食宝塔的水平每天摄入蔬菜500 g(如果蔬菜全为豆芽),可推算人群4-氯苯氧乙酸钠每日暴露水平为0.0017 mg/kg(bw),这一数值远远小于其ADI(0.08 mg/kg(bw))值[26],仅占ADI值的2%,暂时没有暴露风险。2011年卫生部发出公告:由于缺乏食品添加剂工艺必要性,4-氯苯氧乙酸钠不得作为添加剂生产和使用[14],但如果从残留的暴露风险来看,适量使用4-氯苯氧乙酸钠培育出的豆芽并不会像社会上所说的那样是“毒豆芽”。

2.2.3 市场上豆芽4-氯苯氧乙酸钠检测结果 在市场上抽取豆芽样品共32个样进行4-氯苯氧乙酸钠检测,结果如表5。结果提示30个样品中,19、26、30号样品中有4-氯苯氧乙酸钠,其余样品未检出(4-氯苯氧乙酸钠残留量小于0.2 mg/kg),检出率为9.4%。

虽然近几年,我国严打“毒豆芽”,但如今市场上仍有它们的踪迹。本研究从市场上采集的30个样品中,有三个样品检测出4-氯苯氧乙酸钠,说明4-氯苯氧乙酸钠依然在使用。因此,今后在豆芽的生产中,一方面,执法部门应加强监管;另一方面,应开发豆芽安全生产技术,并依据风险评估提出添加剂的使用规范。

表5 市场豆芽4-氯苯氧乙酸钠残留检测结果一览表

注:“-”表示未检出。

3 结论

适宜浓度的4-氯苯氧乙酸钠对绿豆芽生长有促进作用,浸泡法中,4-氯苯氧乙酸钠最适宜浓度为1 mg/L,浸泡喷洒法中除4 mg/L组出现抑制外,其余各组产率接近,对豆芽生长无明显促进作用,综合考虑,浸泡法更适用于豆芽的培育。各处理组豆芽,随着培育时间的增长,4-氯苯氧乙酸钠的残留明显降低。在最后采收时,均未检出,说明4-氯苯氧乙酸钠在培育过程中可能发生降解,安全性较高。

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Analysis of sodium 4-chlorophenxyacetate on mung bean sprouts growth and residue

YANG Jie1,HUANG Shao-wen1,SUN Yuan-ming1,FENG Wen-ying1,HE Le-qian1,HUANG Zhi-guang1,LIU Chun-hong1,2,*

(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2.Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation(Guangzhou),Ministry of Agriculture,Guangzhou 510642,China)

The effect of different doses of sodium 4-chorophenxyacetate treatments on mung bean sprouts growth and residues were studied through the evaluation of the two cultivation methods. Mung bean sprouts were treated with four different doses of sodium 4-chorophenxyacetate nutrient solution:0.5,1,2,4 mg/L,and grew in bean sprout machine. The fresh weight,Axis length,Axis diameter,Root length,germination rate and yield were measured after harvest. According to the results,the better cultivation method was chosen and then the dynamic residue of sodium 4-chlorophenxyacetate were determined. The residues of sodium 4-chlorophenxyacetate in thirty-two samples collected from the market were also determined. The results showed that the best yield was 7.12 for 1 mg/L group in the method 1. In the method 2,except that the 4 mg/L group showed suppression,the growth of other groups were similar to the control group. In method 1,sodium 4-chlorophenxyacetate was downtrend along with time in each treatment group and no sodium 4-chlorophenxyacetate was detected in the last day. In the thirty-two samples from the market,the contents of sodium 4-chlorophenxyacetate in 3 samples were between 1.39 mg/kg to 3.39 mg/kg,and the detection rate was 9.4%. The results suggested that method 1 was better than method 2 from comprehensive consideration. Sodium 4-chlorophenxyacetate could be degraded and eliminated in nurturing process of mung bean sprouts.

sodium 4-chlorophenxyacetate;mung bean sprouts;yield;residues

2014-11-13

杨婕(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：食品质量与安全，E-mail:judy_yang91@163.com。

*通讯作者:柳春红(1968-)，女，博士，教授，研究方向：营养及食品安全，E-mail:liuch@scau.edu.cn。

农业部农产品质量安全风险评估专项(GJFP2014011)；广东省科技计划项目(2012B090600005，2012B091400001)。

TS255.7

A

1002-0306(2015)15-0104-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.014