安丝菌素P—3的摇瓶发酵培养基优化

谷政伟 朱晓媛 黎继烈

摘要：为了优化安丝菌素P-3（AP-3）的摇瓶发酵培养基，以AP-3产量为主要指标，在单因素试验的基础上，利用均匀试验设计U*15（157）对培养基中碳源、氮源和前体异丁醇进行优化。得到最适培养基配方为葡萄糖4.22%，麦芽糖0.75%，玉米浆3.42%，乙酸铵0.41%，异丁醇0.43%，碳酸钙0.50%，氢氧化钠0.12%，磷酸氢二钾0.10%，pH（7.4±0.2）。在此条件下进行验证试验，AP-3产量为（51.86±1.33） mg/L，与模型预测值接近。表明该优化方法切实可行，能够获得较高的AP-3产量。

关键词：安丝菌素P-3；发酵；培养基；优化

中图分类号：TQ920.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2707-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.039

Optimization of Shaking-flask Fermentation Medium for Ansamitocin P-3

GU Zheng-wei，ZHU Xiao-yuan，LI Ji-lie

（Central South University of Forestry and Technology/2011 Cooperative Innovation Center of Cultivation and Utilization for Non-Wood Forest Trees of Hunan Province/Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-wood Forest Trees，Ministry of Education，Changsha 410004，China）

Abstract： In order to optimize the shaking-flask fermentation medium for ansamitocin P-3（AP-3），the yield of AP-3 was used as major index， based on the single experiment， carbon sources， nitrogen sources and precursor isobutanol were optimized by the design method of even experiment U*15（157）.The optimum medium formulas were glucose 4.22%，maltose 0.75%，corn steep liquor 3.42%，ammonium acetate 0.41%，precursor isobutanol 0.43%，CaCO3 0.50%，NaOH 0.12%，K2HPO3 0.10%，pH （7.4±0.2）.Under the above condition， the yield of AP-3 was up to（51.86±1.33） mg/L， closely to the prediction of the model. Relatively high yield of AP-3 was gained by this feasible optimization.

Key words： ansamitocin P-3； fermentation； medium； optimization

安丝菌素（Ansamitocins）是一类由橙色珍贵束丝放线菌（Actinosynnema pretiosum）发酵生成的美登素类抗生素[1]，具有抗肿瘤、抗细菌、抗结核杆菌等生理活性[2，3]，其衍生物可以作为“弹头”与单抗结合形成活性高、副作用小的抗体-药物偶联物（Antibody-drug conjugates，ADCs）[4-7]。根据C-3侧链的碳链长度不同，安丝菌素可分为P-1、P-2、P-3、P-3和P-4五个组成部分，其中安丝菌素P-3是主要发酵产物[8，9]。

培养基组成是发酵过程必须考虑的因素，碳源对微生物生长代谢的作用主要是提供细胞及合成产物的碳架，提供细胞生命活动所需的能量。氮源主要用于合成氨基酸、蛋白质、核酸等菌体细胞物质和含氮代谢物，包含有机氮源和无机氮源，两者通常在发酵过程中混合使用。前体是次级代谢物生物合成的主要限制因素，往往决定抗生素的产量与质量，主要来源于脂肪酸、单糖、蛋白质等含碳物质的代谢，还有些源于主代谢中无作用酶的催化产物。

本研究利用单因素试验考察培养基中不同碳源、氮源对安丝菌素P-3（AP-3）产量的影响，展开均匀试验设计U*15（157）对碳源、氮源和前体异丁醇的浓度进行优化，以期为AP-3和橙色珍贵束丝放线菌的进一步开发与研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：橙色珍贵束丝放线菌（Actinosynnema pretiosum spp. auranticum，APSP-01），由中南林业科技大学发酵工程实验室提供。

主要试剂：AP-3标准品（HPLC）、玉米浆为美国Sigma公司产品；无水甲醇（HPLC）、甘油为分析纯，为天津市富宇精细化工有限公司产品；酵母浸粉为英国OXOID公司产品；麦芽糊精为上海楷洋生物技术有限公司产品：麦芽浸粉、蛋白胨（分析纯）为北京奥博星生物技术有限责任公司产品；可溶性淀粉、蔗糖、无水葡萄糖、氢氧化钠、磷酸氢二钾、95%乙醇、麦芽糖、碳酸钙、异丁醇、琼脂均为国产分析纯。

主要仪器：P680型高效液相色谱仪（美国戴安公司）；CJ-ID型水平超净工作台（天津市泰斯特仪器有限公司）；ZWY-2102C立式全温振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；LDZH-100KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基 ①单菌落分离平板培养基。甘油1.0%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.3%，麦芽浸粉0.3%，琼脂2.0%，pH（6.8±0.2），121 ℃灭菌20 min。②种子培养基。甘油1.0%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.3%，麦芽浸粉0.3%，pH （6.8±0.2），121 ℃灭菌20 min。③初始摇瓶发酵培养基。麦芽糊精5.0%，大豆粉3.0%，碳酸钙0.50%，氢氧化钠0.12%，磷酸氢二钾0.10%，异丁醇0.30%，pH （7.4±0.2）。

1.2.2 培养条件 ①单菌落分离平板培养。将甘油管保藏菌稀释涂布到单菌落分离平板上，于28 ℃的生化培养箱中倒置培养72～144 h。②种子培养。从单菌落分离平板上挖出单菌落，加2 mL无菌水，再加10 个玻璃珠，振荡均匀，制成菌悬液，然后将其接种于种子培养基上（装液量为30 mL/150 mL三角瓶或50 mL/250 mL三角瓶），于全温振荡器中以转速200 r/min、28 ℃条件下培养72 h。③发酵培养。250 mL三角瓶装发酵培养基50 mL，将种子液以5%接种量接入培养基中，于立式全温振荡器中以转速200 r/min、28 ℃条件下培养168 h。

1.2.3 安丝菌素P-3的检测

1）色谱条件。色谱柱为Hyperclone C18柱（250 mm×4.60 mm×5 μm）；流动相为乙腈-水（V/V=70/30）；流速为1.0 mL/min；检测波长为252 nm；柱温为25 ℃；进样量20 μL。AP-3标准品（纯度98%）的HPLC图谱如图1所示，所得AP-3标准品的峰面积为46.264。

2）标准曲线制作。取AP-3标准品用50%乙醇进行稀释分别得到质量浓度为24.035、32.047、48.070、64.093、96.140 mg/L的系列标准溶液。在“1.2.3”中“1）”的色谱条件下平行测定3次，然后以浓度x（mg/mL）为横坐标，平均峰面积y为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程y=0.493 1x-0.890 8，相关系数r=0.998 9。

3）发酵培养液中AP-3的测定。取5 mL发酵液于试管中，加入95%乙醇至10 mL，混合均匀，振荡10 min 后以 8 000 r/min离心5 min除去菌丝体，然后取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC测定，根据标准曲线计算AP-3含量。

1.3 试验设计

试验采用单因素试验和均匀试验设计。利用单因素试验考察了不同碳源、有机氮源和无机氮源对AP-3产量的影响，并根据单因素试验结果，采用均匀试验设计考察了发酵培养基组分葡萄糖、麦芽糖、玉米浆、乙酸铵、异丁醇5种因子对AP-3产量的影响。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同碳源对AP-3产量的影响 分别用5.0%葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉、甘油替代初始摇瓶发酵培养基中的麦芽糊精，其他成分不变，按“1.2”中方法进行试验，探讨不同碳源对AP-3产量的影响，结果如图2所示。由图2可知，当碳源为甘油时，AP-3产量最低，当碳源为葡萄糖时，AP-3产量最高。这是因为葡萄糖是一种速效碳源，是菌体最好的生长碳源；麦芽糖作为碳源时，AP-3产量也较高，这是因为碳源调控可能与次级代谢酶的直接抑制有关，适宜的培养基中一般包含适量的速效碳源和迟效碳源，速效碳源可被菌体快速利用，是菌体最好的生长碳源，但可能影响次级代谢物的形成，迟效碳源通常是发酵生产次级代谢物的最好碳源，可以与速效碳源一起加入。因此，选取葡萄糖、麦芽糖作为组合碳源进行均匀试验设计。

2.1.2 不同有机氮源对AP-3产量的影响 分别用3.0%蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、玉米浆、麦芽浸粉替代初始摇瓶发酵培养基中的大豆粉，其他成分不变，按“1.2”中方法进行试验，探讨不同有机氮源对AP-3产量的影响，结果如图3所示。由图3可知，有机氮源为玉米浆时，AP-3产量最高，使用蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉为有机氮源时，AP-3产量偏低。这是因为有机氮源是影响放线菌正常生长的重要因素，对次级代谢物的产量有重要作用，而玉米浆含有丰富的氨基酸、微量元素和生长素等物质，可能有利于AP-3的产生。因此，选择玉米浆为最佳有机氮源。

2.1.3 不同无机氮源对AP-3产量的影响 在“2.1.2”试验结果的基础上，再在初始摇瓶发酵培养基中分别加入0.3%的硫酸铵、乙酸铵、氯化铵、硝酸铵、碳酸氢铵，其他成分不变，按“1.2”中方法进行试验，探讨不同无机氮源对AP-3产量的影响，结果如图4所示。由图4可知，乙酸铵可以提高AP-3产量，而其他铵盐特别是硝酸铵明显抑制AP-3产量，与专利报道一致[10]。可能原因是添加铵盐等速效无机氮源可供前期菌体的快速生长，然而一定浓度的铵离子对许多次级代谢过程产生负作用，产生铵离子效应，抑制AP-3产量。

2.2 均匀设计试验结果

根据单因素试验结果，采用均匀试验设计考察发酵培养基组分对AP-3产量的影响。选用U*15（157）均匀设计表，考察葡萄糖、麦芽糖、玉米浆、乙酸铵、异丁醇5种因子不同水平对珍贵橙色束丝放线菌APSP-01产AP-3的影响，每组试验重复2 次。U*15（157）均匀设计试验结果如表1所示。

使用DPS 7.05软件对表3的数据进行二次多项式逐步回归分析，得出AP-3产量与各因素关系的方程为：

y=-5.795-0.234x2-74.798x5+0.269x1x2+49.531x1x4+8.818x1x5+7.417x3x4-0.680x3x5+0.503x22+77.806x52

R2=0.989 9，模型P<0.01，回归方程拟合极显著，对所得的回归拟合方程中的变量分别求一阶偏导数，解方程的最优结果为：葡萄糖4.22%，麦芽糖0.75%，玉米浆3.42%，乙酸铵0.41%，异丁醇0.43%，预测AP-3产量的最优结果为53.87 mg/L。在最优条件下进行6次平行试验，AP-3实际产量为（51.86±1.33） mg/L，说明回归模型真实可靠。

3 小结

目前安丝菌素生产水平低，市场价格昂贵。采用微生物发酵法制备安丝菌素具有周期短、费用低、操作简单等优点，是解决上述问题的有效方法。本研究通过单因素试验确定培养基中最适碳源、氮源，展开均匀试验设计U*15（157）优化培养基中两种碳源（葡萄糖、麦芽糖），两种氮源（玉米浆、乙酸铵）和前体异丁醇共5种成分的浓度。优化摇瓶培养基的配方为葡萄糖4.22%，麦芽糖0.75%，玉米浆3.42%，乙酸铵0.41%，异丁醇0.43%，碳酸钙0.50%，氢氧化钠0.12%，磷酸氢二钾0.10%，pH （7.4±0.2），在此条件下，AP-3产量为（51.86±1.33） mg/L，与模型预测值接近。表明该优化方法切实可行，能够获得较高的AP-3产量。这对今后AP-3的进一步研究及其发酵过程放大等工作的展开具有积极意义。

参考文献：

[1] 林锦霞.橙色珍贵束丝放线菌发酵生产抗癌药物安丝菌素P-3的研究[D].上海：华东理工大学，2011.

[2] 康前进.安丝菌素后修饰及安莎类抗生素聚酮链的释放[D].上海：上海交通大学，2010.

[3] 姚骏骅，刘 明.HPLC-ESI/MS测定安丝菌素同系物[J].质谱学报，2008，29（增刊）：108-109.

[4] 曹 刚，黄祚刚，程杰飞，等.抗体药物偶联物[J].化学进展，2014，26（2/3）：467-477.

[5] ERICKSON H K，LAMBERT J M.ADME of antibody-maytansinoid conjugates[J].The APPS Journal，2012，14（4）：799-805.

[6] 石依冉，王 岩，陈少欣.抗体-药物偶联物的研究进展[J].世界临床药物，2013，34（12）：755-759.

[7] WHITEMAN K R，JOHNSON H A，MAYO M F， et al. Lorvotuzumab mertansine，a CD56-targeting antibody-drug conjugate with potent antitumor activity against small cell lung cancer in human xenograft models[J]. mAbs， 2014，6（2）：556-566.

[8] 李婷兰，韦柳静，范宇翔，等.奇迹束丝放线菌合成安丝菌素过程中支链氨基酸的添加效果分析[J].华东理工大学学报，2013， 39（6）：675-680.

[9] 朱晓媛，黎继烈，韦晓菊，等.基于遗传算法的安丝菌素P-3分批发酵动力学研究[J].中国酿造，2013，32（12）：101-104.

[10] 丁靖志，倪穗佳，孟锐奇，等.生产安丝菌素的发酵培养基[P].中国专利：CN 103255184A，2013-08-21.