明胶微冰胶支架有利于脂肪来源间充质干细胞体外干性维持并提高其体内应用价值

毛晓晶，曾 洋，韩 钦*，赵春华*

(1.中国医学科学院 基础医学研究所 组织工程中心， 北京 100005；2.清华大学 医学院 生物医学工程， 北京 100084)



明胶微冰胶支架有利于脂肪来源间充质干细胞体外干性维持并提高其体内应用价值

毛晓晶1，曾 洋2，韩 钦1*，赵春华1*

(1.中国医学科学院 基础医学研究所 组织工程中心， 北京 100005；2.清华大学 医学院 生物医学工程， 北京 100084)

目的研究人脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)与明胶微冰胶材料体外联合培养时，材料是否能维持间充质干细胞的生物学特性。方法ADSCs种植于明胶微冰胶材料后进行Calcein-AM和PI活细胞染色检测细胞活力，细胞滴度蓝法检测细胞增殖能力，定量PCR检测干性基因OCT4、Nanog、SOX2表达情况，以及在成脂成骨诱导过程比较ADSCs在二维环境和种植于明胶微冰胶材料后的分化潜能。结果ADSCs在三维明胶微冰胶支架材料中能保持较高活性，增殖能力不受影响，干性基因表达上调，成脂成骨分化相关基因表达水平比二维诱导环境低。结论明胶微冰胶可以为ADSCs提供一个较二维培养更好的微环境，有利于ADSCs体外干性维持，从而在干细胞移植法治疗相关疾病时以非侵入性的细胞传递方式发挥更长期的应用价值。

人脂肪间充质干细胞；明胶微冰胶

成体干细胞中人脂肪来源间充质干细胞(human mesenchymal stem cells from adipose tissue,hADSCs)迄今已广泛应用于组织工程学基础研究和临床前期研究中。ADSCs具有三方面优势：一是具有自我更新能力和三胚层分化潜能，如分化成脂肪细胞、成骨细胞、内皮细胞、表皮细胞、神经元、肝脏细胞等；二是来源丰富，取材方便，可以大量获取种子细胞；三是具有免疫调节功能，能降低炎性反应和移植排斥反应发生率[1]。ADSCs在正常机体可以一生维持未分化状态，但是在体外培养瓶或皿中时，会经历老化过程，增殖能力减弱[2]。因此间充质干细胞(MSC)在不确定的体内外环境中干性状态能否维持是长期临床应用主要考虑的问题[3]。

生物学支架材料，如胶原、明胶、纤连蛋白和透明质酸，可用于体外培养ADSCs。明胶是胶原蛋白水解后产物，是一种无味、半透明、坚硬的薄片、颗粒或粉末状物质，广泛应用于组织工程中。本研究中使用的明胶微冰胶(gelatin microcryogels)在以前的研究中曾应用于小鼠下肢缺血模型。细胞在明胶微冰胶中用常规胰蛋白酶消化法能够传代生长，二者存在相互作用，本研究将进一步探索在体外培养环境中，生物可降解性的明胶微冰胶三维支架材料如何影响ADSCs增殖分化潜能和干性状态。

1 材料与方法

1.1 试剂

人无菌脂肪组织(西宫整形美容机构，遵循知情同意原则)；明胶(Sigma-Aldrich公司)；Cell Titer-Blue® Cell Viability Assay(Promega公司)；M-MLV反转录试剂盒、SYBR定量PCR试剂盒(Takara公司)；油红O、茜素红(Sigma公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒(天津血液研究所)。

1.2 ADSCs和明胶微冰胶体外联合培养

生物可降解的明胶微冰胶由清华大学生物工程系制备，将冷水鱼明胶与3%戊二醛溶液按6%的质量体积比混合，利用PMM微孔模板技术低温下制备成的颗粒状三维支架材料，制备方法简单、周期短。首先收集状态良好的三代ADSCs并计数，重悬细胞沉淀，以50 μL体积、1.2×107个/mL铺于一个胶块上，置于5% CO2和95%湿度的37 ℃培养箱1.5～2 h，使细胞充分贴附在材料中，然后补足培养皿所需培养基，获得三维明胶微冰胶支架材料(3D)中ADSCs。设置普通二维生长环境(2D)中ADSCs作为对照。

1.3 种植于明胶微冰胶中ADSCs活细胞染色

从培养皿中吸取数粒含有ADSCs的明胶颗粒状材料置于48孔板，D-Hank’s洗掉培养基。避光配制死活细胞染色液，PI(10 μg/mL)和Calcein-AM(2 μmol/L)稀释于D-Hank’s中。将该混合物加入48孔板中，37 ℃孵育15 min，荧光显微镜下观察并拍照。

1.4 Cell Titer-Blue®细胞活力检测

以1.2×107个/mL接种ADSCs，比较细胞在普通二维生长环境(2D)和三维明胶微冰胶支架材料(3D)增殖能力，具体操作方法按照说明书进行。

1.5 2D和3D中ADSCs成脂成骨诱导过程

以2×104个/mL将ADSCs铺于6孔板，待细胞增殖至培养皿60%和80%，分别添加成骨和成脂诱导液，于诱导第5天进行成骨碱磷酶染色，于第10天进行成脂油红O和成骨茜素红染色。以1.2×107个/mL接种ADSCs于明胶微冰胶中，诱导方法同上，收集RNA鉴定成脂成骨相关基因表达情况。

1.6定量PCR检测2D和3D中ADSCs干性基因表达情况

用Trizol法提取体外2D和3D培养环境中ADSCs的RNA，测定RNA浓度，按照反转录试剂盒说明书进行反转录，合成cDNA。Real-time PCR按照试剂盒说明书进行。RT-PCR引物序列(表1)，以GAPDH作为内参。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 结果

2.1ADSCs和明胶微冰胶形态及其联合培养后活细胞染色结果

ADSCs培养扩增至第3代后细胞增殖形态比较一致(图1A)。明胶微冰胶制备后呈现于培养皿，电镜照片显示明胶微冰胶是带有空隙的三维立体结构(图1B)，肉眼观察到材料颗粒是直径400 μm的白色柱状实体(图1C)。这种材料需经过进一步冻干处理，存于-20 ℃备用，进而形成厚度600 μm左右圆形或者方形片状的颗粒聚集体(图1D)。在细胞和材料体内应用前，活细胞染色显示材料中细胞大部分处于存活状态(Calcein-AM：阳性绿色)(图1E,G)，仅有少部分细胞死亡(PI:阳性红色)(图1F,G)。

2.2ADSCs在明胶微冰胶中增殖情况和干性基因表达情况

以1.2×107个/mL接种，初始细胞数量相同，结果显示连续培养3 d两组间的细胞增殖无区别(图2A)。同时还分析了ADSCs干性基因的表达情况，结果显示培养12 h后OCT4、Nanog表达水平在3D环境中明显高于2D(图2B)。

A.ADSCs morphology(×10)；B～D.gelatin microcryogels morphology,B(×100),D(×20)；E～G.ADSCs staining in gelatin microcryogels of Calcein-AM and PI(×20)

A.ADSCs proliferation；B.expression of stemness genes OCT4， Nanog,SOX2 in gelatin microcryogels (3D) compared to 2D； *P<0.05，**P<0.01 compared with ADSCs

2.3ADSCs在二维环境和三维明胶微冰胶中成脂成骨分化能力比较

3种染色结果显示,普通二维培养条件和明胶微冰胶三维培养条件下，ADSCs都具有向成脂和成骨分化的能力(图3)。明胶微冰胶中ADSCs在诱导5和10 d时，成脂分化相关基因PPARγ、AP2、LPL以及成骨分化基因RUNX2、OPN、OC表达水平均比二维诱导环境降低(图4A～F)。

A～B.oil red O staining adipogenic differentiation of ADSCs(×10)；C～D.ALP staining osteogenic differentiation of ADSCs(×4)； E～F.Alizarin red S staining osteogenic differentiation of ADSCs(×4)；A,C,E(2D); B,D,F(3D)

A～C.adipogenic genes expression；D～F.bone differentiation related gene expression；*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.01 compared with ADSCs+microcryogels

3 讨论

干细胞微环境对干细胞命运决定非常关键，包括体内和体外微环境两方面。不同的环境因素，如干细胞和干细胞之间、干细胞和临近分化细胞之间相互作用，以及干细胞受到周围黏附分子、细胞外基质成分、氧张力、生长因子、细胞因子，理化环境中pH、离子强度、代谢产物影响，都会改变基因表达，诱导其增殖或者分化，从而影响干细胞参与组织再生、维持和修复过程[2]。

种子细胞、组织工程支架、细胞因子是构成组织工程的3 大因素，分别相当于田地里的种子、土壤、化肥。作为“土壤”的组织工程支架起细胞外基质作用，不但为种子细胞提供附着、生长、增殖的场所，而且向种子细胞传输化学和力学信号,指导种子细胞的诱导分化、基因表达，使其再生或修复组织[4- 5]。

本研究显示ADSCs在明胶微冰胶中能够正常增殖，活性较高，与ADSCs在普通二维生长环境相比差别不明显。进一步分析干细胞标记基因OCT- 4、SOX- 2和Nanog[6]在二维和三维环境中的动态变化，发现在明胶微冰胶中ADSCs干性基因表达水平高于二维生长环境。这部分结果提示明胶微冰胶作为细胞载体提供了一个比普通二维更好的环境因素，不但保持了ADSCs较强的增殖能力，而且提高了ADSCs干性基因表达水平。此外，种植于明胶微冰胶三维支架材料中的ADSCs在成脂成骨诱导环境下，成脂和成骨染色结果显示具有相似的成脂成骨分化能力，但是相关基因表达上调没有普通二维诱导环境显著。结合干性基因的检测结果提示明胶微冰胶三维支架材料提供的环境因素更有利于ADSCs维持干性。 另外，明胶微冰胶材料在体内应用时，优势在于可以采用直接输注的方式，因此有利于提高ADSCs的体内应用价值。

[1] Yi T，Song SU. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells and their therapeutic applications[J]. Arch Pharm Res，2012，35：213- 221.

[2] Scadden DT. The stem-cell niche as an entity of action[J]. Nature，2006, 441：1075- 1079.

[3] Duffy CR，Zhang R， How SE，etal. Long term mesenchymal stem cell culture on a defined synthetic substrate with enzyme free passaging[J]. Biomaterials，2014， 35：5998- 6005.

[4] Rennert RC，Sorkin M，Januszyk M，etal. Diabetes impairs the angiogenic potential of adipose-derived stem cells by selectively depleting cellular subpopulations[J]. Stem Cell Res Ther， 2014，5：79- 91.

[5] Rustad KC，Wong VW， Sorkin M，etal. Enhancement of mesenchymal stem cell angiogenic capacity and stemness by a biomimetic hydrogel scaffold[J]. Biomaterials， 2012， 33：80- 90.

[6] Hanna JH，Saha K，Jaenisch R. Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues[J]. Cell，2010，143：508- 525.

Gelatin microcryogels benefit human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue to maintain stemnessinvitroand promote application valueinvivo

MAO Xiao-jing1, ZENG Yang2, HAN Qin1*, ZHAO Chun-hua1*

(1.Center of Excellence in Tissue Engineering, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS, Beijing 100005；2.Dept. of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing 100084, China)

ObjectiveTo investigate whether the gelatin microcryogels can maintain biological characteristics of human mesenchymal stem cells from adipose tissue (ADSCs) and enhance the stemness of ADSCs when they are co-culturedinvitro.MethodsCalcein-AM and PI staining were conducted to test cell viability of ADSCs plated in gelatin microcryogels. Cell titer-blue assay was used to examine the cellular proliferating capacity. Real-time PCR was used to evaluate the expression level of the stemness genesOCT4,Nanog,SOX2. Adipogenic and osteogenic differentiation were induced and compared in ADSCs plated in gelatin microcryogels and in conventional environment.ResultsADSCs were biologically active in the 3D scaffolds of gelatin microcryogels. Proliferation rate was not influenced. Stemness genes expression was up-regulated. ADSCs plated in gelatin microcryogels still had osteogenic and adipogenic differentiation ability, but the related genes expression levels were lower in comparison with ADSCs in conventional inducing condition.ConclusionsGelatin microcryogels can provide proper microenvironmental factors for ADSCs stemness maintenance, so as to exert the long-term application value in the diseases treated

human mesenchymal stem cells from adipose tissue(hADSCs); gelatin microcryogels

2015- 01- 11

：2015- 03- 13

国家重大科学研究计划(2011CB964901)

*通信作者(correspondingauthor)：hanqinhanqin@126.com；zhaochunhua@vip.163.com

1001-6325(2015)05-0610-05

研究论文

Q813.1

：A

with stem cell by a minimally-invasive delivery method.