小RNA干扰对氟他胺耐受性前列腺癌细胞LNCaP端粒酶活性的影响机制研究

高晓东

甘肃省中医院血液净化中心（兰州 730050）

小RNA干扰对氟他胺耐受性前列腺癌细胞LNCaP端粒酶活性的影响机制研究

高晓东

甘肃省中医院血液净化中心（兰州 730050）

目的 探讨hTERT基因的两端各三个碱基硫代修饰反义寡核苷酸（AS PS-ODN）对氟他胺耐受性前列腺癌细胞LNCaP端粒酶活性的影响机制。方法 采用TRAP-PCR- ELISA 法检测氟他胺耐受性前列腺癌细胞的端粒酶活性；采用RT-PCR方法检测hTERT基因mRNA 的表达水平；以免疫组化通过流式细胞仪检测hTERT基因蛋白水平的变化。结果 hTERT基因的两端各三个碱基硫代修饰反义寡核苷酸（AS PS-ODN）作用于LNCaP细胞48h，其端粒酶活性下降，作用72h，其端粒酶活性受到抑制。结论 通过hTERT基因的两端各三个碱基硫代修饰反义寡核苷酸（AS PS-ODN）特异性抑制hTERT基因mRNA 的表达降低氟他胺耐受性前列腺癌细胞LNCaP端粒酶活性，为氟他胺耐受性前列腺肿瘤的基因治疗提供新思路。

端粒， 末端转移酶； 寡核苷酸类， 反义； 人类端粒酶催化亚单位； 前列腺肿瘤

前列腺癌是男性癌症死亡的主要原因之一。雄激素阻断疗法是治疗晚期前列腺癌的主要方法。这种方法在治疗雄激素依赖性前列腺癌非常有效。然而，这种恶性肿瘤最终会成为雄激素非依赖性，抗雄激素药物逐渐失去作用，对于雄激素非依赖性前列腺癌的治疗，目前没有一个行之有效的方法，是临床上最棘手的问题之一。如何有效治疗雄激素非依赖性前列腺癌成为目前医学研究的重点之一。端粒酶是目前发现的一种肿瘤特异性标志，与肿瘤细胞的发生和发展关系密切［1］。人类端粒酶主要由3部分组成：人类端粒酶RNA成分（hTR）、人类端粒酶相关蛋白（TEP1）和人类端粒酶反转录酶催化亚单位 （hTERT）。hTR的功能是为染色体端粒延伸起模板作用，hTERT是其活性表达的关键组分和限速因子［2］。Yoo等［3］克隆了hTERT核酸序列，并发现针对模板序列（5'-CUAACCCUAAC-3'）的反义寡核苷酸可抑制其模板作用，从而抑制端粒酶活性。研究表明，良性前列腺增生组织中未发现端粒酶活性表达，而雄激素非依赖性前列腺癌表现出高水平的端粒酶活性，表明端粒酶激活与雄激素非依赖型前列腺癌发生过程关系密切，是雄激素非依赖性前列腺癌治疗的新靶点［3］。近年来有研究表明，抑制hTERT的表达活性会破坏肿瘤细胞对DNA双键断裂的反应，影响整个染色体的形态［4］，达到对肿瘤细胞增生的抑制作用。我们曾经通过研究hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸（AS PS-ODN）对膀胱癌细胞T24端粒酶活性的影响。本实验通过研究hTERT基因的两端各三个碱基硫代修饰反义寡核苷酸（AS PS-ODN）对氟他胺耐受性前列腺癌细胞LNCaP端粒酶活性的影响，探讨端粒酶活性的抑制机理，为氟他胺耐受性前列腺癌寻找新的基因治疗方法提供体外实验依据。

材料与方法

一、材料

（一）主要试剂

PMBI-1640培养粉为北京天为时代科技有限公司产品，胎小牛血清为兰州民海生物制品公司产品，端粒酶检测试剂盒购自南京凯基生物公司，Trizol RNA提取试剂盒及RT-PCR试剂盒购自上海生工生物工程技术公司，hTERT蛋白抗体和异硫氰酸荧光素标记的兔抗羊免疫球蛋白为北京中山生物制品公司产品。

（二）引物合成

根据hTERT基因mRNA的序列分析，设计出互补于起始密码子的反义片段共20个碱基长度作用的靶序列。hTERT AS PS-ODN的序列为5'-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3'，S PS-ODN的序列为5'-CCCGCGATGCCGCGCGCTCC-3'，每一条链进行两端各三个碱基硫代修饰，由北京赛百胜生物制品公司合成，纯化，分装。hTERT上游引物为5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'；下游引物为5'-GGATGAAGCGCAGTCTGGA-3'。内对照β-肌动蛋白（β-actin）基因上游引物为5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'；下游引物为5'-GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，均由上海生工生物工程技术公司合成。

（三）细胞培养

LNCaP细胞株由兰州大学第二医院泌尿研究所惠赠。采用含100mL/L胎小牛血清（60℃灭活3 min）、100 u/mL青霉素和100 u/mL链霉素的PMBI-1640培养基，在37℃、50mL/LCO2饱和湿度条件下，LNCaP细胞含10%FBS的RPMI 1640培养液中培养。氟他胺用无水乙醇溶解后加入磷酸盐缓冲液（PBS，常规培养于pH7.2）至氟他胺终浓度为10-4mol/L储存。LNCaP加入氟他胺至终浓度为10-7mol/L后连续培养80代，使之成为氟他胺耐受性前列腺癌细胞LNCaP-flu［5］，实验选用对数生长期细胞。

二、方法

（一）hTERT

AS PS-ODN 最适作用浓度的选择 实验分为AS PS-ODN组（实验组）、S PS-ODN组及空白对照组。采用24孔培养板，每组接种3孔，每孔接种1×105细胞。寡核苷酸浓度分为4组，第1天向培养液中分别加入5，10，15，20μmol/L，第2，3天追加原剂量的一半；空白对照组加入相同量的培养液。观察时间为24，48，72h。采用台盼蓝拒染法计数细胞，并收集细胞进行端粒酶活性检测，得出最适作用浓度（SPS-ODN作用浓度与之相同）。

（二）端粒酶活性检测

实验分为AS PS-ODN组、S PS-ODN组及空白对照组。采用24孔培养板，每组接种3孔，每孔接种1×105细胞。采用TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性，按试剂盒说明书操作。用最适浓度10μmol/L的ODN处理后，收集寡核苷酸处理不同时间的LNCaP细胞（24 h，48 h，72 h），用PBS洗涤细胞2次，加入1mL冰冷的Wash buffer，置冰上5 min，4℃离心（19 000×g， 5 min）；弃上清后加入40 μL冰冷的Lysis buffer，置冰上30 min 4℃离心（19 000×g， 30 min）；离心后上清测定其蛋白浓度至5～10 μg/mL。取5μL PCR扩增产物，加入20μL变性试剂，置室温孵育10 min，加入225 混合液，（含地高辛标记的检测抗体），混匀后转100μL混合液于抗生物素包被的微孔板上，37℃杂交2h，加入过氧化物酶偶联的地高辛抗体（anti-DIG-POD）100μL，室温孵育30 min。最后加入过氧化物酶底物四甲基对氨基联苯（TMB）孵育10min，加入终止液终止反应。测定450nm和655nm吸光度（A）值。

（三）采用RT-PCR方法检测hTERT基因mRNA的表达水平

实验分为AS PS-ODN组、S PS-ODN组及空白对照组。用最适浓度10μmol//L的ODN处理后，收集寡核苷酸处理不同时间的LNCaP细胞（24 h，48 h），用Trizol RNA提取试剂盒提取总RNA，按照MMLV一步法RT-PCR试剂盒的操作步骤进行RT-PCR检测。EP管中加入RT-PCR buffer 25μL，模板RNA 1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，M-MuLV RT1μL，加入无菌双蒸水至50μL。以β-actin 作为内对照进行PCR扩增。PCR条件：1循环：37～40℃ cDNA 合成30min；38循环：94℃变形15s，60℃退火30s，72℃延伸1min；1循环： 72℃延伸10min。扩增产物在15g/L琼脂糖凝胶上电泳，凝胶分析仪分析结果。

（四）流式细胞仪测定hTERT基因蛋白的表达水平

收集寡核苷酸处理不同时间的LNCaP细胞（24 h，48 h，72 h）1×105，在4℃、70mL/L的乙醇液中固定15 min，加入含10ml/L的吐温-20穿透缓冲液洗2次，加入hTERT基因抗体50μL，4℃孵育1h， 缓冲液洗2次，加入异硫氰酸荧光素标记的兔抗羊免疫球蛋白50μL，4℃孵育30min， 缓冲液洗2次，置流式细胞仪上检测。

三、统计学分析

结 果

一、AS PS-ODN对氟他胺耐受性前列腺癌LNCaP细胞端粒酶活性的影响

TRAP-PCR-ELISA法结果显示，与S PS-ODN组及空白对照组相比，实验组加入AS PS-ODN 48 h后，LNCaP细胞端粒酶活性明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

图1 3组对氟它胺耐受性前列腺癌LNCaP细胞端粒酶活性的影响比较

二、AS PS-ODN对氟他胺耐受性前列腺癌LNCaP细胞hTERT基因mRNA的影响

RT-PCR法结果显示，AS PS-ODN作用于LNCaP细胞24， 48h， hTERT基因mRNA 相对表达量分别与S PS-ODN组及空白对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 3组对氟它胺耐受性前列腺癌LNCaP细胞hTERT基因mRNA的影响比较（）

表1 3组对氟它胺耐受性前列腺癌LNCaP细胞hTERT基因mRNA的影响比较（）

与AS PS-ODN组相比，*为P＜0.05

时间（h）24 48空白对照组 0.68±0.16* 0.75±0.28* AS PS-ODN组 0.60±0.10 0.58±0.12 S PS-ODN组 0.27±0.0* 0.05±0.0*

三、AS PS-ODN对氟他胺耐受性前列腺癌LNCaP细胞hTERT基因蛋白表达水平的影响

流式细胞仪测定结果显示，AS PS-ODN作用于LNCaP细胞24， 48h，72h后， hTERT基因蛋白表达的阳性细胞的百分率分别与S PS-ODN组及空白对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2，图2）。

图2 AS PS-ODN作用于氟它胺耐受性前列腺癌LNCaP细胞48h，72h后，荧光显微镜下hTERT基因蛋白表达水平A： AS PS-ODN作用48 h（40×）； B： AS PS-ODN作用72 h（40×）

表2 3组对氟它胺耐受性前列腺癌LNCaP细胞hTERT基因蛋白表达水平的影响比

表2 3组对氟它胺耐受性前列腺癌LNCaP细胞hTERT基因蛋白表达水平的影响比

与AS PS-ODN组比较，*为P＜0.05

时间（h）24 48 72空白对照组 85.30±4.60 86.65±5.0 84.85±2.25 AS PS-ODN组 86.80±5.10 85.50±2.88 85.40±4.72 _S PS-ODN组 82.41±2.34 70.25±4.55* 43.15±5.20*

讨 论

有关文献报道，90%以上的氟他胺耐受性前列腺癌表达端粒酶活性［6］，因而抑制端粒酶活性具有对氟他胺耐受性前列腺癌基因治疗的应用前景［7］。目前研究报道［8］，hTERT基因mRNA在氟他胺耐受性前列腺癌各种癌细胞株及肿瘤组织中表现出高水平的表达，与本实验结果相符。

反义技术的基本原理就是根据碱基互补原则，用人工合成或生物体表达的特定互补的DNA或RNA片段（反义核酸）以抑制或封闭专一靶基因表达的技术。本实验采用两端各三个碱基硫代修饰反义核酸。硫代是指硫元素代替磷酸基团自由氧，是目前反义核酸应用研究最多的一种修饰，可以增强反义核酸的稳定性，提高反义核酸对核酸酶的耐受性，使其药物半衰期增加10倍，同时增强反义核酸对肿瘤细胞的亲核性，从而使反义核酸更容易进入肿瘤细胞核内发挥其抗肿瘤作用。

本实验端粒酶活性检测结果表明，hTERT AS PSODN 作用48 h 后， LNCaP细胞端粒酶活性明显下降，作用48 h 后， LNCaP细胞端粒酶活性明显受到抑制。S PS-ODN处理24h， 48h， 72h，LNCaP细胞端粒酶活性无明显变化。RT-PCR结果显示，hTERT AS PS-ODN 作用24 h 后， hTERT基因mRNA表达水平下降，作用48h 后，hTERT基因mRNA表达水平明显下降。S PS-ODN处理24h，48h，LNCaP细胞hTERT基因mRNA表达水平无变化。流式细胞仪测定结果显示，AS PS-ODN作用于LNCaP细胞24， 48h，72h后，hTERT基因蛋白表达的阳性细胞的百分率明显下降，S PS-ODN作用于LNCaP细胞24， 48h，72h后， hTERT基因蛋白表达的阳性细胞的百分率无变化。以上结果表明，hTERT AS PS-ODN可在mRNA水平和蛋白质水平上影响hTERT基因的表达。

AS PS-ODN与目的基因mRNA通过碱基互补结合，从而与处于不同时期的mRNA杂交，阻止RNA加工，成熟，出核，影响核糖体结合或沿mRNA移动，同时激活RNase H，剪切杂交链中未配对碱基，特异性分解RNA-DNA杂交链中的RNA链。本实验采用Antisense原理，这与文献报道的有关反义核酸作用的研究一致［9，10］。实验还证明，两端各三个碱基部分硫代碱基稳定性已很理想，与hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸实验结果一致。

总之，hTERT AS PS-ODN通过降低hTERT mRNA水平和蛋白质水平的表达抑制氟他胺耐受性前列腺癌LNCaP细胞端粒酶的活性，从而为氟他胺耐受性前列腺肿瘤的基因治疗提供了新的思路。

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（2014-07-07收稿）

Effects of hTERT mRNA antisense on telomerase activity in utamide insensistive prostate cancer cells LNCaP in vitro

Gao Xiaodong
The Traditional Chinese Medicine Hospital of Gansu Province， Lanzhou 730050， China

Objective To investigate the effects of hTERT antisense oligodeoxynucleotide on telomerase activity in utamide insensistive prostate cancer cells （LNCaP）. Methods Telomerase activity was measured by Telomerase PCR ELISA kit. hTERT mRNA expression was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） assay，and hTERT protein expression by immunohistochemistry and flow cytometry. Results The telomerase activity was decreased after LNCaP cells were treated with AS PS-ODN for 48 h， and it was evidently inhibited after 72 h intervention. Conclusion AS PS-ODN could signi cantly inhibit the telomerase activity in utamide insensistive prostate cancer cells.

telomerase； oligodeoxynucleotide， antisense； human telomerase reverse transcriptase； prostatic neoplasms

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.07.004

R 737.25