产肠球菌素乳酸菌发酵条件优化及其性质研究

闵钟熳，羿丽杰，姜宇（沈阳师范大学粮食学院，辽宁沈阳110034）

产肠球菌素乳酸菌发酵条件优化及其性质研究

闵钟熳，羿丽杰，姜宇
（沈阳师范大学粮食学院，辽宁沈阳110034）

摘要：以自主分离的一株屎肠球菌BC-3为研究对象，对其代谢产生细菌素的发酵条件进行优化，得到最佳发酵条件为：发酵时间20 h、pH 6.5、接种量1.5%、温度37℃，抑菌圈直径可达17.87 mm。进一步经硫酸铵沉淀粗提，对肠球菌素E3的部分性质进行研究，结果表明：肠球菌素E3具有很好的耐热性，超声波及紫外线短时处理对其稳定性没有影响，表面活性剂TritionX-114对其活性会有一定的抑制作用。

关键词：屎肠球菌；肠球菌素；发酵优化；性质

肠球菌能够发酵葡萄糖产生乳酸，属于乳酸菌。某些肠球菌可以代谢产生细菌素统称为肠球菌素。目前已经分离和鉴定了许多肠球菌素，其中屎肠球菌（Enterococcus faecium）为主要生产菌，可以代谢产生具有抑菌活性的小分质量的类细菌素，且相关研究表明这些类细菌素具有热稳定性强[1]、pH作用范围广等优良的生物学特性。

本研究以实验室自主分离的一株产细菌素的屎肠球菌BC-3为研究对象，对其产生肠球菌素E3的发酵条件进行优化，并对E3的部分生物学性质进行了研究。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料

屎肠球菌（Enterococcus faecium）BC-3：自主分离；大肠杆菌（Escherichia coli）：沈阳师范大学创新中心实验室保存；培养基：MRS培养基、LB培养基[2]。

1.1.2仪器

Thermo（MODEL868）pH计、Kendor离心机：美国科峻仪器公司；SW-CJ型超净工作台：上海爱明仪器有限公司；DHP-781恒温培养箱：日本爱朗；YXQ型电热高压蒸汽灭菌锅：上海医用核子仪器厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。

1.2试验方法

1.2.1抑菌效果测定

采用滤纸片法[3-4]，取3次试验的平均值。抑菌圈直径包括滤纸片直径（6 mm）。

1.2.2单因素试验

1.2.2.1发酵时间的影响

将BC-3菌株接入MRS培养基中，其他培养条件不变，发酵至40 h，在不同培养时间内取样，测定发酵液的活菌数及上清液的抑菌圈直径，取3次试验平均值。

1.2.2.2培养温度的影响

保持其他培养条件不变，温度分别为25、30、37、42℃条件下，培养20 h，测定发酵液的吸光值及上清液的抑菌圈直径，取3次试验平均值。

1.2.2.3pH的影响

保持其他培养条件不变，pH分别为5、6、7、8条件下，培养20 h，测定发酵液的吸光值及上清液的抑菌圈直径，取3次试验平均值。

1.2.2.4接种量的影响[5]

保持其他培养条件不变，接种量为1%、2%、3%、4%条件下，培养20 h，测定发酵液的吸光值及上清液的抑菌圈直径，取3次试验平均值。

1.2.3正交试验

为了确定最优发酵条件组合，取发酵时间、pH、接种量、温度四因素三水平进行优化。因素水平设计见表1。

表1　正交试验因素水平表L（934）Table 1　Factors and levels of orthogonal test L（934）

1.2.4肠球菌素E3生物学性质的研究

1.2.4.1硫酸铵沉淀

粗提肠球菌素E3，采用硫酸铵沉淀法[6]。

1.2.4.2温度对肠球菌素E3稳定性的影响

分别取等量的肠球菌素E3粗提液，于EP管中，在60、80、100、120℃下，分别加热10、20 min，测定温度对其稳定性的影响。

1.2.4.3表面活性剂对肠球菌素E3稳定性的影响

将SDS、吐温20、吐温80、Trition X-100、Trition X-114加入到E3粗提液中，表面活性剂的终浓度为1%，同体积稀释原液为对照，37℃保温5 h，测其抑菌活性。

1.2.4.4超声波对肠球菌素E3稳定性的影响

分别取等量的肠球菌素E3粗提液，于EP管中，使用超声波处理30、60、120、180次，工作功率400 W，工作时间3 s，间隔时间4 s，未处理为对照，测抑菌活性。

1.2.4.5紫外线对肠球菌素E3稳定性的影响

分别取等量的肠球菌素E3粗提液至含磁力搅拌子的无菌平皿中，在距离30 cm、15 W紫外灯下，分别处理0、10、30、60、90 min，测定其对肠球菌素E3稳定性的影响。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1发酵时间的影响

不同发酵时间对屎肠球菌BC-3生长及肠球菌素E3产量的影响，见图1。

图1　发酵时间对屎肠球菌BC-3生长及肠球菌素E3产量的影响Fig.1　Effect of fermentation time on cell growth and enterococcin E3 production

结果显示，菌株在4 h～16 h为对数生长期，16 h后进入稳定期，代谢产物不断积累，随发酵时间的増长而增大，当培养至20 h时，抑菌性最高，此时抑菌圈直径达到最大，为16.34 mm。

2.1.2温度的影响

不同培养温度对屎肠球菌BC-3生长及肠球菌素E3产量的影响，见图2。

结果显示，屎肠球菌BC-3吸光值及肠球菌素E3产量都随温度升高而增大，温度达到37℃时，达到最大值，此时抑菌圈为16.33 mm。

2.1.3pH的影响

不同的pH对屎肠球菌BC-3生长及肠球菌素E3产量的影响，见图3。

结果显示，在较低pH下，菌体生长缓慢，随pH增加其生长速度及抑菌活性逐渐增加，当pH为6时，菌体浓度达到最大，此时抑菌活性也达到最大，抑菌直径为16.24mm。

图2　温度对屎肠球菌BC-3生长及肠球菌素E3产量的影响Fig.2 Effect of temperature on cell growth and enterococcin E production

图3　pH对屎肠球菌BC-3生长及肠球菌素E3产量的影响Fig.3　Effect of pH value on cell growth and enterococcin E3 production

2.1.4接种量的影响

不同的接种量对屎肠球菌BC-3生长及肠球菌素E3产量的影响，见图4。

图4 接种量对屎肠球菌BC-3生长及肠球菌素E3产量的影响Fig.4　Effect of inoculation amount on cell growth and enterococcin E3 production

结果显示，随着接种量加大，菌体浓度增加，当接种量为2%时，抑菌活性达到最大，此时抑菌圈的直径为16.66 mm。

2.2正交试验确定最优组合

通过单因素试验，选取发酵时间、pH、接种量、温度，进行四因素三水平正交试验，结果见表2。

表2正交试验结果Table 2　The results of orthogonal test

由表2结果可知，各因素对细菌素产量的影响程度依次为：发酵时间>温度>pH>接种量。屎肠球菌BC-3产肠球菌素E3的最优发酵组合A2B3C1D2。即：发酵时间20 h、pH6.5、接种量1.5%、温度37℃时，细菌素产量最高，此条件下的抑菌圈直径可达17.87 mm。

2.3肠球菌素E3的性质

2.3.1温度对肠球菌素E3稳定性的影响

肠球菌素E3粗提液经不同温度处理后，其抑菌活性变化，见图5。

图5　温度对肠球菌素E3稳定性的影响Fig.5　Effect of temperature on the stability of enterococcin E3

由图5可知，与对照相比，肠球菌素E3经不同温度处理后，对其抑菌活性影响较小。经120℃热处理15 min后，抑菌活性仍保持90%左右。

2.3.2表面活性剂对肠球菌素E3稳定性的影响

肠球菌素E3经表面活性剂处理后，其稳定性见表3。

从表3可知，肠球菌素E3经SDS、吐温20、吐温80作用后稳定性没有受到影响，而Trition X-100、Trition X-114对其活性有抑制作用，尤其Trition X-114会使其抑菌活性明显降低。

表3　表面活性剂对肠球菌素E3稳定性的影响Table 3　Influence of surface active agents on the stability of enterococcin E3

2.3.3超声波对肠球菌素E3稳定性的影响

肠球菌素E3经超声波处理后，其稳定性见表4。

表4　超声波处理对肠球菌素E3稳定性的影响Table 4　Effect of ultrasonic on the stability of enterococcin E3

从表4可知，与对照相比，肠球菌素E3经不同程度超声波处理后，其稳定性几乎没有受到影响，表明该细菌素对超声波处理不敏感。

2.3.4紫外线对肠球菌素E3稳定性的影响

肠球菌素E3经紫外线处理后，其稳定性见表5。

从表5可知，30 min内紫外线照射对肠球菌素E3稳定性没有影响，随着处理时间增加，稳定性开始下降，当照射90 min后，活性几乎丧失，因此短时间内紫外线照射对其影响不大。

表5　紫外线照射对肠球菌素E3稳定性的影响Table 5　Effect of UV irradiation on the stability of enterococcin E3

3　结论

通过单因素和正交试验，对屎肠球菌BC3发酵条件进行优化，得到最佳发酵时间为20 h、pH为6.5、接种量为1.5%、培养温度为37℃时抑菌活性最高，此时抑菌圈直径可达17.87 mm。进一步对肠球菌素E3的部分性质进行了研究，结果表明肠球菌素E3具有耐热性，超声波及紫外线短时处理对其稳定性没有影响，表面活性剂TritionX-114对其活性有一定的抑制作用。以上表明，肠球菌素E3具有优良的稳定性，在食品防腐中有很好的应用前景。

参考文献：

[1]Drider D,Fimland G,Hechard Y,et al.The continuing story of classⅡa bacteriocins[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2006, 70(2):564－582

[2]周德庆.微生物实验学教程[M].北京:高等教育出版社,2002

[3]田宇,洪芳,胡承,等.类型菌素产生菌HF08的选育及其发酵条件的研究[J].食品发酵工业,2004,30(3):56-61

[4]曾维才,谭敏,张佳琪.不同抑菌方法在食品防腐剂效果评价方面的比较[J]食品安全质量检测学报,2010,27(3):112-117

[5]常峰,易奎星,刘小兰,等.类细菌素高产菌CF10的筛选诱变及发酵条件的研究[J].食品科学,2006,27(1):143-148

[6]周伟,李平兰,周康,等.温度、pH及盐析对植物乳杆菌素L-1作用单核细胞增生李斯特氏菌的影响[J].食品科学,2006(2):121-126

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.040

收稿日期：2014-04-09

基金项目：辽宁省农业青年科技创新人才项目（2015053）；辽宁省教育厅科学研究项目（L2012389）

作者简介：闵钟熳（1982—），女（汉），讲师，博士，研究方向：食品质量与安全。

Study on Optimization of Enterococcin Produced by Lactic Acid Bacteria and Biological Characteristics

MIN Zhong-man，YI Li-jie，JIANG Yu
（College of Grain Science and Technology，Shenyang Normal University，Shenyang 110034，Liaoning，China）

Abstract：We studied a Enterococcus faecium BC-3，which is stored in the laboratory，can produced bacteriocins.Fermentation conditions were optimized as follows：fermentation time 20 h，pH6.5，inoculation 1.5%，temperature 37℃，inhibition zone diameter achieved 17.87 mm.Further，to extract E3 with ammonium sulfate，and studied some of its properties.The results showed that：enterococci E3 had good heat resistance，ultrasonic and short-term ultraviolet treatment had no effect on its stability，but a surfactant TritionX-114 had some inhibitory effect on its activity.

Key words：Enterococcus faecium；enterococcin；optimization of fermentation conditions；characteristics