全小麦固体制曲条件优化研究

黄俊伟，彭睆睆，崔 春，王智荣

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510641）

米曲霉是我国传统酿造业使用的菌种，被美国FDA认可为GRAS级别，已被广泛运用到多种传统调味品、新型呈味基料及酶制剂的开发中。制曲的目的是使米曲霉在原料上充分生长，分泌发酵所需各种酶类，在后续的发酵中将大分子物质降解成可溶性小分子[1]。在米曲霉分泌的碱性蛋白酶和中性蛋白酶作用下，大分子的蛋白质被降解成多肽和游离氨基酸。因此，蛋白酶活是评价成曲质量的重要指标，会对原料蛋白质利用率和成品质量有重要影响[2]。传统调味品如酱油的主要原料是大豆或者豆粕，近年来利用其他原料制备调味品或呈味基料的研究报道也越来越多，例如夏克胜等[3]利用马氏珍珠贝肉固体制曲制备呈味基料，探讨了制曲过程中酶活与氮源营养代谢的关系；蔺立杰等[4]利用响应面法优化了核桃酱油的制曲工艺，利用全小麦进行制曲，系统研究制曲条件对成曲酶活影响的研究鲜见报道。与大豆相比，小麦蛋白质谷氨酸含量极高，是生产高品质调味品的优质原料[5-6]。

本文以米曲霉作为菌种，全小麦作为制曲基料，以成曲的中性和酸性蛋白酶活为评价指标，全面考察了米曲霉曲精来源、原料粗细度、曲料初始水分含量、制曲湿度、培养温度和培养时间对小麦曲的影响并优化了其制曲工艺，以期为新型呈味基料和调味品的开发生产提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦 含碳水化合物75.2%，蛋白质11.9%，粗脂肪1.3%，购买于市场；光明牌曲精 上海酿造一厂；鼎鑫牌曲精 鼎鑫酿造食品科学研究所；企业曲精广东佛山酱油厂；实验室曲精 实验室分离制得，所有曲精均为沪酿3.042米曲霉孢子粉，质量指标满足：孢子数≥100亿/克干基，孢子发芽率≥80%，水分≤10%；福林试剂 参照SB/T 10317-1999配制；干酪素 生化试剂；其余均为分析纯。

FA2004分析天平 上海天平仪器厂；JYS-900型立式杀菌锅 利宏轻工机械有限公司；HPX-9052MBE型恒温培养箱 常州诺基仪器有限公司；101A-0型数显电热鼓风干燥箱 苏州学森仪器设备有限公司；DK-S26型电热恒温水浴锅 上海申贤恒温设备厂；GL-21M型高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器公司；DFT200型手提式高速万能粉碎机 上海精胜科学仪器设备公司；紫外可见UV-2000型分光光度计 尤尼柯（上海）仪器设备公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制曲流程 制曲过程参考黄婵媛[6]的制曲工艺流程为：

全小麦→焙炒→粉碎→润水→造粒→出曲→测定蛋白酶活

1.2.2 不同种类曲精对成曲酶活力的影响 取生小麦各250 g，分别在140℃条件下焙炒30 min，粉碎加水至曲料初始水分含量为50%造粒，分别接入鼎鑫牌、光明牌、企业和实验室自制四种曲精0.5‰（以加水后小麦重量计）制曲，自然湿度条件下培养44 h出曲，测定成曲中性和酸性蛋白酶活力。

1.2.3 原料粗细度对成曲酶活力的影响 焙炒后的小麦粉碎物通过10、20和40目的筛子，以实验1.2.2确定的光明牌曲精作为菌种，自然湿度条件下培养44 h出曲，测定成曲中性和酸性蛋白酶活力。

1.2.4 湿度对成曲酶活力的影响 按上述所确定的种曲来源和原料粉碎细度，研究自然条件不控制湿度（恒湿RH 90%），对照组（控湿）对成曲酶活力影响。对照组（控湿）是指0～24 h为95%的湿度；24～36 h为90%湿度；36～40 h为80%的湿度；40～44 h为70%的湿度。大曲培养44 h出曲，测定成曲中性和酸性蛋白酶活力。

1.2.5 曲料初始水分含量对成曲酶活力的影响 按上述所确定的条件，加水使各曲料初始水分含量分别为45%、47%、49%、51%、53%、55%，控湿培养44 h出曲，测定成曲中性和酸性蛋白酶活力。

1.2.6 培养时间对成曲酶活力的影响 根据以上单因素实验确定的种曲来源，原料粗细度，培养湿度和曲料初始水分含量为制曲条件，从制曲36 h开始，每隔4 h取一次样，连续取样6次直至56 h出曲，测定成曲中性和酸性蛋白酶活力。

1.2.7 培养温度对成曲酶活力的影响 根据以上确定的培养条件，分别以28、30、32℃初始培养温度培养，控湿培养48 h出曲，测定成曲中性和酸性蛋白酶活力。

1.3 分析方法

1.3.1 水分含量的测定 直接干燥法，参考GB5497-85[7]。

1.3.2 蛋白酶活的测定 参考SB/T 10317-1999[8]，采用福林酚法测定。

1.4 数据分析

所有测试重复进行三次，使用SPSS 14.0软件对数据进行单因素方差分析。

2 结果与讨论

2.1 曲精种类对成曲酶活的影响

曲精是经过试管培养、三角瓶培养、进一步扩大培养后再分离得到的处于休眠状态的米曲霉孢子，具有使用方便、容易保存、与种曲相比质量更稳定等优点，目前已被许多调味品生产企业广泛使用[9]。不同品牌曲精成曲蛋白酶活的影响如图1所示。尽管本实验所用的曲精均为沪酿3.042米曲霉孢子，但是不同成曲间蛋白酶活存在显著性差异（p＜0.05）。光明牌成曲各项酶活力最高，其中性蛋白酶为1044 U/g，酸性蛋白酶为322 U/g；鼎鑫牌成曲的中性蛋白酶酶活力最低，仅为946 U/g；实验室成曲具有最低的酸性蛋白酶活，其酶活为226 U/g。有研究表明，曲精是多种微生物的混合体，不同品牌曲精及种曲微生物分布、水分活度、水分含量和蛋白酶活存在显著性差异[10]，这与本文结果一致。综合考虑中性和酸性蛋白酶活，选用光明牌曲精来进行后续的工艺优化研究。

图1 曲精种类对成曲蛋白酶活力的影响Fig.1 Effect of A.oryzae HN 3.042 spores type on the enzyme activity of koji

2.2 原料粗细度对成曲蛋白酶活的影响

原料粉碎的目的是增加米曲霉的繁殖面积和酶的作用面积。曲料固体颗粒具有合适的比表面积，既有利于曲霉菌的呼吸、散热，又可使酱料生产过程简单易行，易于实现工业大规模生产。原料粗细度对成曲蛋白酶活的影响结果如图2所示。不同粗细度成曲其蛋白酶活存在显著性差异（p＜0.05），随着原料粉碎程度的增加，成曲蛋白酶活呈现先增加后降低的趋势。20目过筛的成曲其中性和酸性蛋白酶活最高，分别为1160 U/g和333 U/g，酶活较10目筛成曲明显增加，这可能是因为适度粉碎原料可以提高原料吸水量，增加原料的表面积，有利于米曲霉菌丝深入原料内部，提高成曲酶活。当使用40目过筛原料制曲时，其中性和酸性蛋白酶活反而降低，这可能是因为原料过细吸水易结块，制曲过程由于通风不便易烧曲，降低了成曲酶活。因此，选用20目过筛的原料来进行后续优化实验。

图2 原料粗细度对成曲酶活力的影响Fig.2 Effect of the raw material thickness degrees on the enzyme activity of koji

2.3 培养湿度对成曲蛋白酶活的影响

米曲霉的整个生长阶段可以分为4个阶段：孢子发芽期、菌丝生长期、菌丝繁殖期、孢子着生期[3]，在不同的生长阶段米曲霉对环境条件的要求也不尽相同，培养湿度会对米曲霉的菌丝生长和成曲酶活等产生重要影响。湿度过低，会导致原料制曲过程中由于产热而水分挥发；湿度过高，空气中的水分易在原料上冷凝，成曲容易受到杂菌的污染[11]。培养湿度对成曲蛋白酶活的影响结果如图3所示。采用控湿制曲的小麦成曲其中性和酸性蛋白酶活分别高达1449 U/g和388 U/g，较恒湿制曲组酶活分别提高了11.29%和28.90%，这说明控湿制曲可以有效提高成曲酶活，在实际生产过程中可以使用具有控湿功能的机械设备来控制制曲湿度，提高成曲质量。

图3 培养湿度对成曲酶活力的影响Fig.3 Effect of culture humidity on the enzyme activity of koji

2.4 曲料初始水分含量对成曲酶活的影响

微生物的生命活动离不开水，曲料中的初始水分含量会对米曲霉的活性有很大的影响，进而影响到成曲的质量。一般而言，培养米曲霉的曲料最适初始水分含量在45%～55%之间。曲料初始水分含量过低，会导致曲料润水程度不够，曲料在制曲过程中由于微生物产热而造成曲料过干微生物生长受阻，成曲酶活下降；另一方面，曲料水分过少会导致米曲霉繁殖不充分，甚至提前结孢子，变成老曲，菌丝瘦段，成曲酶活不高。初始水分过多，会降低曲料的通风效果，导致酶活下降。另外，水分过多一方面会导致原料中营养物质被曲霉过分消耗，另一方面曲料也易受杂菌污染。例如，芽孢杆菌或者产酸菌迅速繁殖会影响米曲霉的繁殖，产生粘曲或酸曲，严重影响制曲的质量[12]。曲料初始水分含量对成曲酶活的影响如图4所示。随着曲料初始水分含量的上升，成曲蛋白酶活呈现先增加后下降的趋势。在初始水分含量为51%时，成曲的中性和酸性蛋白酶活均为最高，分别达到了1462 U/g和364 U/g。曲料中适当的水分含量能够促进米曲霉的生长繁殖，提高成曲的酶活。因此，选用51%初始水分含量来进行后续的优化研究。

图4 曲料初始水分含量对成曲酶活力的影响Fig.4 Effect of the moisture content on the enzyme activity of koji

2.5 培养时间对成曲蛋白酶活力的影响

中性和酸性蛋白酶活随固体制曲时间的变化如图5所示。制曲起始阶段，米曲霉刚开始萌芽，然后菌丝开始生长，产生了大量的肉眼可见的白色菌丝，曲料发白，此时曲中的中性和酸性蛋白酶活处于一个较低的水平。随着制曲时间的延长，在36 h曲霉孢子开始着生，产酶能力开始旺盛，小麦曲的蛋白酶活急剧增加，曲料呈现淡黄绿色；到48 h大曲酶活达到顶峰，中性和酸性蛋白酶活分别高达1462 U/g和364 U/g，显著高于其他制曲时间的成曲酶活（p＜0.05），曲料的颜色也逐渐加深，呈现嫩黄绿色。48 h后，随着制曲时间的延长，米曲霉处于过生长状态，中性和酸性蛋白酶活不断下降。由图5可知，发酵时间对中性蛋白酶活的影响很大，而对酸性蛋白的影响较不明显，综合考虑两种蛋白酶活指标，选择制曲时间48 h为宜。

图5 培养时间对成曲酶活力的影响Fig.5 Effect of culture time on the enzyme activity of koji

2.6 培养温度对蛋白酶活的影响

培养温度是影响大曲蛋白酶活的重要因素，它与米曲霉孢子的萌发，菌丝体的生长，酶系的分泌及大曲酶活高低关系密切。研究表明，30～35℃是米曲霉的最适生长温度[13]。培养温度对蛋白酶活的影响如图6所示。不同的培养温度下的成曲酶活存在显著差异（p＜0.05），随着培养温度的提高，成曲中性和酸性蛋白酶活呈不断上升的趋势，其中32℃的成曲其蛋白酶活最高。温度较低时，米曲霉孢子的萌发速度较慢，菌体生长繁殖受阻，大曲容易感染杂菌，故成曲酶活较低；但是培养温度较高也会对成曲酶活造成不利影响。一方面，制曲过程中菌株的生长发育会产出大量的热，导致成曲品温上升，通风条件不好的情况下容易出现烧曲现象；另一方面，制曲培养温度过高，耐高温的微生物例如根霉等会在曲料上生长，导致大曲出现浓重的氨味。此外，在实验过程中发现当培养温度超过32℃，随着温度的升高，曲中营养物质被微生物生长繁殖大量消耗，成曲质量不断下降。因此，综合考虑蛋白酶活、出曲量和杂菌感染情况，选择制曲温度为32℃为最优条件，此时大曲的中性蛋白酶活为1583 U/g干重，酸性蛋白酶活为497 U/g干重，比黄婵媛[6]的最优条件下的中性和酸性蛋白酶活分别提高了12.75%和4.63%。

图6 培养温度对成曲酶活力的影响Fig.6 Effect of culture temperature on the enzyme activity of koji

3 结论

不同品牌曲精成曲的酶活存在显著差异，这是因为不同品牌曲精的微生物状态不同，孢子的活力和种曲水分含量也不相同；光明牌曲精具有良好的孢子活力，可作为曲精来源。控湿制曲（0～24h RH 95%，24～36h RH 90%，36～40h RH 80%，40～44h RH 70%）可有效提高小麦曲的蛋白酶活，与恒定湿度RH 90%制曲相比，其中性蛋白酶和酸性蛋白酶活分别提高了11.29%和28.90%。通过单因素实验确定全小麦制曲的最优工艺为：焙炒小麦粉碎过20目筛、曲料初始水分含量为51%、培养时间48 h、培养温度32℃，控湿制曲（即0～24 h湿度95%，24～36 h湿度90%，36～40 h湿度80%，40～44 h湿度70%）。此时大曲的中性和酸性蛋白酶活分别高达1583 U/g干重和497 U/g干重。

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