栀子黄对α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究

李春英，夏依拉·艾尼，+，毛建卫，龚金炎（.浙江大学生物系统与食品科学学院，食品科学与营养系，浙江杭州30058；2.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江杭州30023；3.浙江省农业生物资源生化制造协会创新中心，浙江杭州30023）

栀子黄对α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究

李春英1，夏依拉·艾尼1，+，毛建卫2，3，龚金炎2，3
（1.浙江大学生物系统与食品科学学院，食品科学与营养系，浙江杭州310058；2.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江杭州310023；3.浙江省农业生物资源生化制造协会创新中心，浙江杭州310023）

栀子黄是传统中药栀子的主要开发产品，在食品、药品等领域得到广泛应用。本文通过单因素实验对底物浓度、酶量和反应时间等进行工艺条件优化。在此基础上，研究了栀子黄对α-葡萄糖苷酶的抑制效果及酶抑制动力学。结果表明：体外研究α-葡萄糖苷酶抑制活性的最佳反应体系为底物浓度为3 mmol/L、酶量为50 μL、反应时间为50 min；栀子黄对嗜热芽孢杆菌来源的α-葡萄糖苷酶没有表现出抑制活性，而对猪胰肠来源的α－葡萄糖苷酶、大米α－葡萄糖苷酶和酵母α－葡萄糖苷酶表现出不同的抑制活性，且抑制类型为竞争性抑制。因此，栀子黄具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。本研究对提升降糖效果和解析降糖机制的相关研究方面具有重要的参考价值。

栀子黄，抑制动力学，α-葡萄糖苷酶

中药栀子（Gardenia jasminoides Ellis）属于茜草科（Ruacbieae）栀子属植物。我国产5种，在河南、江浙、江西、湖南等地都有分布［1］。栀子黄是栀子的主要活性成分［2］，具有清热祛火，凉血利胆，降低胆固醇的作用。栀子黄因为安全性高，在美国、英国、加拿大等国很畅销，特别在日本对栀子黄色素年需量则达到320 t［3］。

我国栀子资源丰富，近年来对栀子的研究方兴未艾，但对栀子黄的精制、功能特性研究较少，且研究多集中在栀子黄的抗氧化功能上［4］。已有文献报道，栀子黄可以降低血清总固醇、甘油三酸酯、低密度脂蛋白水平［5］。栀子及其有效部位能降低类固醇诱导的糖尿病小鼠的血糖［6］。可对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖有降低作用［7］。但关于栀子及其活性成分对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的文献很少。有研究发现环烯醚萜类和栀子黄对α-葡萄糖苷酶的活性均有显著的抑制作用［8］。

α-糖苷酶抑制剂可以延缓碳水化合物的消化吸收，降低餐后血糖峰值和降低血糖波动以及糖化血红蛋白含量。α-葡萄糖苷酶来源广泛，有动物源、植物源以及微生物源。目前，市场上所售的α-葡萄糖苷酶来源及价格均不同，而大部分的α-葡萄糖苷酶研究者研究及开发α-葡萄糖苷酶抑制剂时使用酵母源或细菌源α-葡萄糖苷酶。本文为了研究栀子黄对α-葡萄糖苷酶抑制活性，利用α-葡萄糖苷酶，首先建立体外测定抑制α-葡萄糖苷酶活性的最优反应体系，其次研究栀子黄的α-葡萄糖苷酶抑制动力学特性，最后探讨其不同来源α-葡萄糖苷酶的抑制特性。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

栀子、栀子黄粉末杭州毕尔锐思生物技术有限公司提供；对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pnitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）、不同来源α-葡萄糖苷酶Sigma公司；猪胰肠α-葡萄糖苷酶自制；其他试剂均为分析纯。

电子精密天平OHAUS公司；基础酶标仪美国Thermo Fisher公司；磁力搅拌器德国IKA公司；恒温电热水浴锅上海精宏实验设备有限公司；TDL-5离心机上海安亭科学仪器厂；恒温培养箱上海爱郎仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1pNPG法测定α-葡萄糖苷酶活力反应流程将栀子黄（或空白组为磷酸缓冲液KPB） 用KPB（100 mmol/L，pH7.0）稀释成相应的浓度→置于96孔板中→加一定量0.075 U α-葡萄糖苷酶→加50 μL一定浓度底物pNPG→在37℃条件下反应30 min→加入Na2CO（3100 mmol/L）终止反应→37℃条件下反应10 min后，在405 nm的波长下用酶标仪测定吸光值。

1.2.2最佳反应体系的建立传统的α-葡萄糖苷酶法如Pierre等［9］的方法，以pNPG为底物，Na2CO3溶液作为终止液，在37℃，pH为6.8左右时测定α-葡萄糖苷酶活性。所以本实验考察底物pNPG浓度（0.75、1.5、3、6、12、24 mmol/L）、酶用量（20、30、40、50、60、70 μL）和反应时间（10、20、30、40、50、60、70 min）等因素对栀子黄抑制α-葡萄糖苷酶活性的影响。当底物浓度改变时酶用量（50 μL）和反应时间（30 min）不改变、当酶用量改变时底物浓度（3 mmol/L）和反应时间（30 min）不改变、当反应时间改变时底物浓度（3 mmol/L）酶用量（50 μL）不改变。具体操作按照1.2.1给出的实验流程进行。

1.2.3栀子黄对α-葡萄糖苷酶活性抑制效果不同浓度栀子粉末（0.05、0.125、0.25、1、2、3 mg/mL）和不同浓度栀子黄粉末（0.00625、0.025、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL），利用以上述建立的最优反应体系测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性并计算IC50值。同时设定相同体系下的样品背景对照组，以阿卡波糖为阳性对照。α-葡萄糖苷酶抑制活性按下列公式计算：

1.2.4栀子黄对α-葡萄糖苷酶活性抑制动力学实验根据栀子黄对α-葡萄糖苷酶活性抑制确定动力学实验所用抑制剂浓度。加入不同浓度的底物pNPG（0.75、1.5、3、6、12、24 mmol/L），按上述方法测定不添加抑制剂和添加不同浓度抑制剂时，不同浓度底物下的反应速度。按Lineweave-Burk法作图，以1/［S］为横坐标，1/V为纵坐标，绘制栀子黄的抑制作用动力学曲线，确定抑制类型。

1.2.5栀子黄对不同来源α-葡萄糖苷酶的抑制活性根据1.2.3确定的栀子黄浓度以按上述建立的最优反应体系测定栀子黄对猪胰肠、大米、酵母、嗜热芽孢杆菌来源的α－葡萄糖苷酶抑制活性。以阿卡波糖为阳性对照，其结果IC50（半抑制率浓度）来表示。

1.2.6统计分析实验数据均以均数±标准差表示（Mean±SD，n=3），并采用SPSS 20.0统计软件进行处理，多组间均数比较采用单因素方差分析.

2　结果与分析

2.1反应体系的确定

在药物筛选过程中，传统检测α-葡萄糖苷酶抑制剂活性的方法为分光光度法。底物浓度、pH、酶量、反应时间等因素都对酶活力有影响，而且不同来源的酶，其活力、性质等存在差异，所以在测定酶抑制活性时，建立完善的反应体系，以获得准确可信的酶活性测定数据是十分重要的。所以本实验优化底物浓度、酶量和反应时间建立最优反应体系。

图1　底物浓度对反应体系的影响Fig.1　Effect of substrate concentration on reaction system

2.1.1底物浓度的选择由图1可见，当底物浓度超过3 mmol/L时，吸光度增加值趋于平缓，说明此时酶活力基本保持不变，酶和底物有最佳的配比，故酶反应的最适底物浓度为3 mmol/L。

2.1.2最适酶量的选择由图2可见，当酶量超过50 μL时，吸光度不再随酶量的增加而增加，并且随着酶量的继续增加反而出现了下降趋势，说明此时底物已经消耗完全，再增加酶量，会出现酶过量，则可能不能正常反应抑制活性，故最适酶量为50 μL。

图2　酶体积对反应体系的影响Fig.2　Effect of amount of enzyme on the reaction system

图3　反应时间对反应体系的影响Fig.3　Effect of reaction time on the reaction system

2.1.3反应时间的确定由图3可见，随着时间的增加吸光值也随增大，在50 min时进入到平稳期，说明此时酶与底物已完全反应，在增长时间则可能会影响正常反应抑制活性，所以最佳作用时间为50 min。所以得出的最佳反应体系为：底物PNPG浓度3 mmoL/L，酶用量50 μL，反应时间50 min。

2.2栀子黄对α-葡萄糖苷酶活性抑制动力学实验

研究不同浓度栀子提取物与栀子黄对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果，结果表明栀子提取物和栀子黄对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，其抑制效果随浓度增大而增加。相同浓度下，栀子黄的抑制效果显著高于栀子提取物（见图4）。

图4　栀子提取物和栀子黄对α-葡萄糖苷酶的抑制作用曲线Fig.4　The inhibitory effect of Gardenia jasminoides extracts and Gardenia Yellow on α-glucosidase

图5　栀子黄双倒数抑制曲线Fig.5　Lineweaver-Burk curves of Gardenia Yellow

基于Lineweaver-Burk的方法，构建栀子黄的酶抑制动力学曲线。由图5可知，三条直线在误差允许范围内交于Y轴正半轴，添加栀子黄后，可以看出反应速率相对无抑制剂组来说明显下降，随抑制剂浓度的增大，反应速率降低但反应速度Vmax保持不变，米氏常数Km随抑制剂浓度增加而变大。可以判定栀子黄对α-葡萄糖苷酶属于典型的竞争性抑制类型。

栀子黄抑制类型为竞争性抑制，说明抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，并于酶形成可逆的酶抑制剂复合物，阻止底物与酶结合。从而干扰了酶与底物的结合，使酶促反应速度下降，使酶的催化活性降低，这为我们研究栀子黄的降血糖作用机制提供了实验依据。

2.3栀子黄对不同来源α-葡萄糖苷酶的抑制活性

栀子黄对不同来源α－葡萄糖苷酶抑制作用结果见表1。从表1可以看出，阿卡波糖对猪胰肠α-葡萄糖苷酶和大米来源α-葡萄糖苷酶表现出抑制活性，对酵母与嗜热芽孢杆菌来源的α-葡萄糖苷没有表现出抑制活性。栀子黄对猪胰肠α-葡萄糖苷酶、大米来源的α-葡萄糖苷酶、嗜酵母来源的α-葡萄糖苷酶均表现出抑制效果。IC50分别为669.7、184.3、135.2 μg/mL，对嗜热芽孢杆菌来源的α-葡萄糖苷酶没有表现出抑制活性。

表1　栀子黄对不同来源α-葡萄糖苷酶的抑制活性Table 1　Inhibitory effect of Gardenia Yellow against α-glucosidase from various origins

栀子黄能有效抑制体外α-葡萄糖苷酶活性，这可能是其有效控制血糖的原因。由于体外酶和体内酶有一定差异性，还需进一步验证体内抑制作用，通过体内模型研究栀子黄对α-葡萄糖苷酶的抑制效果，并研究其发挥作用的有效剂量，为体内降血糖机制提供理论依据；栀子黄α-葡萄糖苷酶抑制物质对于靶酶的来源表现出不同的活性，说明每种α-葡萄糖苷酶抑制成分针对靶酶的来源具有一定的选择性。

3　结论

栀子黄能有效抑制体外α-葡萄糖苷酶活性，这可能是其有效控制血糖，尤其是餐后血糖的原因。作为安全性高的中药材栀子的重要活性成分栀子黄在最佳反应体系为底物浓度为3 mmol/L、酶量为50 μL、反应时间为50 min时具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。栀子黄对α-葡萄糖苷酶抑制活性为竞争性抑制。其嗜热芽孢杆菌来源的α-葡萄糖苷酶没有表现出抑制活性，而对猪胰肠来源的α-葡萄糖苷酶、大米来源α-葡萄糖苷酶和酵母来源α-葡萄糖苷酶均表现出抑制活性。这为今后开展栀子降血糖活性的研究，开发无毒无副作用的α-葡萄糖苷酶抑制剂具有重要的意义。

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京：科学出版社，1999.

［2］王钢力.栀子属植物化学成分研究进展［J］.中国中药杂志，1996，21（2）：67.

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［8］肖小华，王丽华，徐丽瑛，等.栀子抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（8）：210-212

［9］Pierre C，Roland R，Tremblay D，et al.P-Nitrophenol-αgluco-pyramoside，as substrate for measurement of maltase activity inhuman semen［J］.J Clin Chem，1978，24：208-211.

Study on the inhibitory effect of Gardenia Yellow on α-glucosidase activity

LI Chun-ying1，SHAHIRA·Hani1，+，MAO Jian-wei2，3，GONG Jin-yan2，3
（1.Department of Food Science and Natrition School of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China；2.Zhejiang University of Science and Technology School of Biological and Chemical Engineering，Zhejiang Provincial Key Lab for Chem&Bio Processing Technology of Farm Produces，Hangzhou 310023，China；3.Zhejiang Collaborative Innovation Center of Chemical and Biological Manufacturing for Agricultural Biological Resources，Hangzhou 310023，China）

Gardenia Yellow is the prime developed product of the traditional Chinese medicine Gardenia，are widely used in food，pharmaceutical and other fields.In this paper，an optimum system was established to study the alpha-glucosidase inhibitory activity through the single factor on substrate concentration，the amount of enzymes and reaction time.On that basis，the effect of Gardenia Yellow on alpha-glucosidase inhibitory and kinetics of enzyme inhibition were studied.The results showed that the best reaction system of alpha-glucosidase inhibitory activity was as follows：substrate concentration was 3 mmol/L，amount of enzyme was 50 μL and reaction time was 50 min，inhibition level was more significant for the alpha-glucosidase systems originate from pig pancreas and intestinerice，and Saccharomyces cerevisiae，but not for the Bacillus subtilis.Inhibitory characters of Gardenia Yellow on alpha-glucosidase belongs to a competitive inhibition system.Research on hypoglycemic component from Gardenia Yellow and studying the mechanisms had significant practical value and also could broad the application prospects，then of course will lay a solid theoretical basis for the future search of traditional Chinese medicine on treating diabetes.

Gardenia Yellow；inhibitory kinetics；Alpha-glucosidase

TS201.1

A

1002-0306（2015）24-0112-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.24.015

2015－03－31+：并列第一作者

李春英（1971-），女，副教授，主要从事天然产物生理活性方面的研究，E-mail：cyli@zju.edu.cn。夏依拉·艾尼（1990-），女，在读硕士研究生，主要从事天然产物生理活性方面的研究，E-mail：xayiral9@126.com。

国家十二五科技支撑计划资助项目（2011BAD23B02）。