芡实种皮多酚抗疲劳耐缺氧作用研究

陈　蓉，吴启南（.苏州市食品药品检验所，江苏苏州2504；2.南京中医药大学药学院，江苏南京20046）

芡实种皮多酚抗疲劳耐缺氧作用研究

陈蓉1，吴启南2，*
（1.苏州市食品药品检验所，江苏苏州215104；2.南京中医药大学药学院，江苏南京210046）

目的：研究芡实种皮多酚的抗疲劳耐缺氧作用。方法：将昆明小鼠随机分为空白组、阳性对照组（维生素E，50 mg/kg·d-1）、多酚高（400 mg/kg·d-1）、中（200 mg/kg·d-1）、低剂量组（100 mg/kg·d-1），分别灌胃给药，每日1次，连续5 d，观察芡实种皮多酚对小鼠体重、负重游泳时间、常压耐缺氧时间、肝糖原、肌糖原、乳酸脱氢酶、血尿素氮和组织一氧化氮的含量，以及免疫器官指数变化的影响。结果：高、中、低剂量种皮多酚均能延长负重小鼠游泳时间和常压密闭耐缺氧时间，显著提高了小鼠的抗应激能力（p＜0.05）。其活动量、食量、精神状态、日均体重增加量、脏器系数得到提升。同时，芡实种皮多酚提高了疲劳小鼠肝糖原、肌糖原储备，降低了血清尿素氮水平，提高了血清和肝脏中乳酸脱氢酶含量，增加了血清中一氧化氮含量。结论：芡实种皮多酚具有抗疲劳和提高耐缺氧能力的作用。

芡实种皮，多酚，抗疲劳，耐缺氧

芡实为睡莲科植物芡（Euryale ferox Salisb）的干燥成熟种仁［1］。始载于《神农本草经》，列为上品［2］，具有益肾固精，补脾止泻，祛湿止带的功效，是药食两用的佳品。产地加工后的余料芡实种皮数量大，但利用率低，常作为秋收后的废物被丢弃，容易造成环境污染。种皮中富含多酚，具有一定的生物活性，可作为天然植物栲胶的来源［3］。目前，对芡实的药效学研究多为多糖和黄酮类成分［4-5］，种皮多酚的活性研究较少。多酚类物质具有多种药理作用，能够抗氧化［6］、抗肿瘤［7］、保护心血管系统［8］、保护脑及神经系统［9］以及缓解体力疲劳［10］。

疲劳分为两种：躯体性疲劳和精神性疲劳［11］，抗疲劳就是延缓疲劳的产生和加速疲劳的消除。目前评价运动性疲劳的方法普遍应用的主要有耐力实验与生化检测。游泳时间长短反映了运动耐力的大小，而运动耐力的提高是抗疲劳能力加强的最直接表现［12］。缺氧对机体是一种劣性刺激，影响机体各种代谢，特别是氧化供能，最终导致机体心脑等重要器官因供氧不足而死亡。本实验利用小鼠游泳时间作为判断耐力程度的客观指标来间接反映机体的抗疲劳能力，通过常压耐缺氧实验判断小鼠的抗应激能力，以维生素E作为阳性对照药［13］，对芡实种皮多酚进行小鼠抗疲劳耐缺氧研究，为开发新型食品保健品提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

芡实种皮多酚南京中医药大学生药学实验室自制（磷钼钨酸显色法测得含量为113.30 mg/g）［3］；昆明小鼠体重18～22 g，环境适应1周，由上海斯莱克实验动物公司提供，动物许可证号：SCXK（沪）2007-0005；氯化钠注射液安徽丰原药业股份有限公司；钠石灰上海陆都化学试剂厂；天然维生素E海南养生堂药业有限公司；乳酸脱氢酶试剂盒（批号：20110412）、一氧化氮试剂盒（批号：20110322）、尿素氮试剂盒（批号：20110319）、肝糖原/肌糖原试剂盒（批号：20110329） 购自南京建成生物工程研究所。

FSH-2A可调高速电动匀浆机金坛市金南仪器厂；universal-32R高速冷冻离心机德国Hettich公司；LXJ-ⅡB低速大容量多管离心机南京晓晓仪器设备有限公司；Powerwave X340全波长酶标仪美国Bio-Tek公司；HH-S电热恒温水浴箱巩义市英峪予华仪器厂；WH-90A微型漩涡混悬器上海振荣科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1动物分组与喂养取健康小鼠60只，雌雄各半，随机分成5组：对照组，灌服生理盐水；VE组（阳性对照），灌服VE生理盐水溶液50 mg/kg·d-1；芡实种皮多酚高剂量组，灌服多酚生理盐水溶液400 mg/kg·d-1；芡实种皮多酚中剂量组，灌服多酚生理盐水溶液200 mg/kg·d-1；芡实种皮多酚低剂量组，灌服多酚生理盐水溶液100 mg/kg·d-1。

1.2.2一般情况的测定保持室温25℃，相对湿度50%，按时给药，自由进食，观察给药期间各组小鼠饮食、排泄情况，给药前及处死前分别称重，分析体重变化，计算增长率［14］。

1.2.3负重游泳实验每组随机抽取12只小鼠，共60只，连续灌胃5 d，末次给药30 min后，将小鼠尾部系上相当于其体重5%的重物，置于水槽中（30 cm× 30 cm×50 cm），水深40 cm，水温25℃，记录小鼠自游泳开始至头部沉入水中8 s不能浮出水面的时间，即为小鼠负重游泳时间［15］，并计算延长率。

1.2.4常压耐缺氧实验每组随机抽取12只小鼠，共60只，连续灌胃5 d，末次给药1 h后，将小鼠放入盛有5 g钠石灰的250 mL广口瓶中，瓶口涂抹凡士林密封，立即计时，以呼吸停止为指标，记录小鼠存活时间［16］。

1.2.5肝糖原和肌糖原含量的测定每组随机抽取12只小鼠，共60只，连续灌胃5 d，末次给药24 h后，将小鼠投入水槽游泳，平均15 min后捞出，放置10 min后，眼眶取血，处死，迅速取其肝脏和肌肉组织，用生理盐水漂净，滤纸吸干，取0.5 g，加入5%三氟乙酸2 mL，匀浆，3500 r/min离心15 min后，分别取上清液，按照试剂盒说明书操作方法，测定肝糖原和肌糖原含量［17］。

1.2.6乳酸脱氢酶（LDH）和尿素氮（BUN）含量的测定取1.2.5下小鼠，眼眶取血，所得血液样本于冰箱静置后，3500 r/min离心15 min分离血清，按照试剂盒说明书操作方法，测定血清LDH和BUN含量。取血后处死，迅速取其肝脏组织，用生理盐水漂净，滤纸吸干，取0.5 g，匀浆，3500 r/min离心15 min后，分别取上清液，按照试剂盒说明书操作方法，测定肝组织LDH含量［18］。

1.2.7一氧化氮（NO）含量的测定取1.2.5下小鼠，取血后处死，迅速取其肝脏、脑、心肌组织，用生理盐水漂净，滤纸吸干，取0.5 g匀浆，3500 r/min离心15 min后，分别取上清液，按照试剂盒说明书操作方法，测定肝脏、脑、心肌组织NO含量。

1.2.8免疫器官指数测定取1.2.5下小鼠，取血后处死，迅速取出肝、心、脾、脑，生理盐水漂净，滤纸吸干，修去脂肪、系膜，称重。

1.3统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计分析，数据以“均数±标准差”（x±s）表示，组间比较采用T检验，多组比较用单因素方差分析（One way ANOVA），检测的显著水平为α=0.05或α=0.01，用“*”及“**”标记显著性。

2　结果与分析

2.1对小鼠表现状态的影响

各组小鼠精神状态较好，色光滑，饮食、大小便无异常，提示芡实种皮多酚有助于提高小鼠活动力。由表1可知，各组体重均呈增长趋势，多酚高剂量组增重显著（p＜0.05），其余各组日增重量未表现出显著性差异（p＞0.05）。表明中低剂量芡实种皮多酚无明显增加小鼠体重的作用。

表1　芡实种皮多酚对小鼠体重的影响（n=12，x±s）Table 1　Effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on body weigh（tn=12，x±s）

表2　芡实种皮多酚对小鼠游泳时间的影响（n=12，x±s）Table 2　Effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on swimming time（n=12，x±s）

2.2对小鼠游泳时间的影响

由表2可以看出，各剂量多酚组小鼠游泳耐力均高于空白组（p＜0.05），并且在一定范围内，随着剂量的增加，小鼠负重游泳时间延长。说明一定浓度的种皮多酚能增强小鼠游泳耐力，能对抗小鼠运动性疲劳，防止运动导致的氧化损伤。与空白组比较，VE组亦能极显著延长小鼠负重游泳时间（p＜0.01）。

表3　芡实种皮多酚对小鼠常压耐缺氧的影响（n=12，x±s）Table 3　Effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on hypoxia tolerance time（n=12，x±s）

2.3对小鼠常压耐缺氧能力的影响

从表3可以看出，多酚组、VE组与空白组相比，小鼠耐缺氧存活时间均延长了25%以上，达到了极显著水平（p＜0.01）。种皮多酚中剂量组延长率更高，达到了60.65%，明显高于VE组；低剂量组也与阳性组相当。提示芡实种皮多酚能够提高小鼠的耐缺氧能力，对机体在应激条件下减少伤害有积极作用。

表4　芡实种皮多酚对小鼠运动后肝糖原和肌糖原的影响（n=12，x±s）Table 4　Effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on the contant of muscle and liver glycogen（n=12，x±s）

2.4对运动后小鼠肝糖原和肌糖原含量的影响

从表4可知，不同剂量的芡实种皮多酚对运动后小鼠的肝糖原和肌糖原影响不同。与空白组相比，多酚高、中、低剂量组能极显著提高小鼠的肝糖原水平（p＜0.01），并且优于VE组。而对肌糖原的影响，各组差别较大，多酚高剂量组、VE组显著高于空白组肌糖原水平（p＜0.05），多酚中剂量组和低剂量组均低于空白组，但未呈显著性差异（p＞0.05）。进食后过多的糖可在肝脏和肌肉中合成糖原储存起来，以免血糖过高。上述结果提示，芡实种皮多酚可促进其糖原合成，特别是提高了肝糖原的储存能力，对维持血糖相对恒定十分有利。当肌肉活动剧烈时，肌糖原分解成大量的乳酸，而大量的芡实种皮多酚能使得肌糖原储存能力加强，延长了运动时间，也节省了本身的肌糖原。

表5　芡实种皮多酚对运动后小鼠LDH和BUN含量的影响（n=12，x±s）Table 5　Effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on LDH and BUN conten（tn=12，x±s）

2.5对运动后小鼠乳酸脱氢酶（LDH）和血清尿素氮（BUN）含量的影响

从表5中可以看出，与空白组相比，灌服芡实种皮多酚、VE的小鼠血清LDH、肝脏LDH活力都有不同程度的增加。运动后小鼠的血清BUN与空白组相比，都有不同程度的降低，其中多酚高剂量组表现出了极显著差异（p＜0.01）。LDH能有效地加速清除运动后产生的乳酸，BUN随机体对运动负荷的适应力增强而减少，提示芡实种皮多酚有提高机体LDH降低血清BUN的功能，对恢复机体体力十分有利，从而提高了机体抗疲劳作用。

2.6对运动后小鼠组织一氧化氮（NO）含量的影响

NO是近年来生命科学研究领域中最热点的课题之一，与心血管、神经、胃肠、泌尿、免疫系统、肾病、肝病、糖尿病、肿瘤、创伤、感染、器官移植排斥反应和性功能调控等都有密切关系［19-20］。实验结果表明（表6），与空白组相比，芡实种皮多酚组、VE组肝、脑、心组织NO含量均有一定提高，其中中剂量组表现最优，提示对NO的调节作用可能与给药剂量不呈线性关系，中剂量组可能接近促进NO提高的最佳剂量。中剂量组心组织NO含量极显著高于空白组（p＜0.01），中、低剂量组脑组织NO含量也比空白组有显著提高（p＜0.05），但高剂量多酚组对肝组织NO含量影响不明显。提示芡实种皮多酚辅助提高组织中一氧化氮合酶活性，减少长时间运动导致的心脑组织NO含量的降低。

表6　芡实种皮多酚对运动后小鼠不同组织NO的影响（n=12，x±s）Table 6　Effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on tissue NO conten（tn=12，x±s）

2.7对小鼠脏器系数的影响

实验结果表明（表7），芡实种皮多酚高、中、低剂量组、VE组与空白组比较，肝、心、脾、脑等主要脏器系数均无显著差异（p＞0.05），表明芡实种皮多酚和VE对小鼠主要脏器无明显增重作用。

表7　芡实种皮多酚对小鼠脏器系数的影响（n=12，x±s）Table 7　Effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on the organ coefficien（tn=12，x±s）

3　结论与讨论

本实验以生理盐为水空白对照、VE为阳性对照，考察芡实种皮多酚是否具有抗疲劳和提高耐缺氧能力。结果表明，与空白组相比，高、中、低剂量组小鼠负重游泳时间和常压密闭耐缺氧时间均延长，显著提高了小鼠的抗应激能力，在文献报道［21-22］传统芡实药材及其不同提取部位具有抗氧化作用的基础上更进一步。给以多酚的各组小鼠，其活动能力、食量、精神状态、日均体重增加量、肝脏和心脏脏器系数均有一定提升。同时，芡实种皮多酚提高了疲劳小鼠肝糖原、肌糖原储备、降低了血清尿素氮水平、提高了血清和肝脏中乳酸脱氢酶含量、增加了血清中一氧化氮含量。证实芡实种皮多酚确实具有调节生理生化功能的作用。

天然来源的中药由于其副作用少，不含对人体有害的兴奋剂而成为近年来抗疲劳研究的热点。芡实废弃物种皮除作为染料外，还具备生物活性。参照《保健食品检验与评价技术规范》［23］中缓解体力疲劳功能和提高缺氧耐受力判定标准，结合实验结果，可初步判定芡实种皮多酚具有抗疲劳耐缺氧作用，其机制可能是通过增加机体能源储备、改善缺氧、及时消除疲劳产物加速疲劳消除。因此，今后在此基础上可以从抗氧化、能量代谢及分子生物学等多方面深入研究，以期能为新型食品保健品开发提供科学依据。

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Effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on anti-fatigue and hypoxia tolerance

CHEN Rong1，WU Qi-nan2，*
（1.Suzhou Institute for Food and Drug Control，Suzhou 215104，China；2.College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China）

Objective：To observe the effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on anti-fatigue，hypoxia tolerance in mice.Methods：Kunming mice were randomly divided into blank group，positive control group（vitamin E，50 mg/kg·d-1），and polyphenols high-dose（400 mg/kg·d-1），medium-dose（200 mg/kg·d-1），lowdose（100 mg/kg·d-1）group，all mice were administered by intragastric administration，once a day for 5 consecutive days.Then，effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on mice body weight，weight loading swimming ability，time of bearing hypoxia at normal pressure，hepatic glycogen，muscle glycogen，lactate dehydrogenase，blood urea nitrogen，tissue nitric oxide content and immune organ index.Results：Polyphenols group of high，medium，low dose could extend mice swimming time and hypoxia tolerance time，enhance antistress ability evidently（p＜0.05）.In addition，activity，appetite，mental state，average daily weight increase and immune organ index were improved.Polyphenols could increase hepatic glycogen，muscle glycogen reserve，serum LDH content，tissue and serum NO content，decrease serum BUN content.Conclusion：Semen Euryales seed coat polyphenols showed the effect of anti-fatigue and enhancing hypoxia tolerance.

Semen Euryales seed coat；polyphenols；anti-fatigue；hypoxia tolerance

TS201.1

A

1002-0306（2015）24-0100-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.24.012

2015－05－11

陈蓉（1986-），女，硕士，主管中药师，研究方向：中药品质评价，E-mail：kedingyu@126.com。

吴启南（1963-），男，教授，研究方向：中药品质评价，E-mail：qnlxw@yahoo.com.cn。

“十二五”国家科技支撑计划项目（2011BAI04B06）。