排石冲剂对大鼠草酸钙结石生成的干预效果及其机制研究

曹秋实，巴元明，罗俊华，王洁钰

尿路结石是临床上的常见病、多发病，其患病率为1%～15%［1］。该病治疗后易复发，10年复发率高达50%［2］，严重影响人们的身心健康。现代医学对于尿路结石的治疗存在疗效不确切、有不良反应等不足。近20多年来，微创外科技术在临床应用较广泛，但仍存在冲击波及外科手术可能引起创伤性损伤及急性肾功能损伤等问题［3］。手术患者还将面临结石被摘除或排出体外后，高达60% ～80%的复发率［4］。因此，积极寻求一种疗效确切、安全的防治结石的新疗法，是国内外医学界一直关注的问题。

中医治疗尿路结石已有数千年的历史，积累了丰富的临床经验，在结石的防治中具有独特疗效和优势。排石冲剂在传统中医辨证论治基础上，辨病与辨证相结合，针对尿路结石的主要发病机制，组方选药配制而成，在临床30余年的应用中，取得了显著疗效［5］。为了探讨排石冲剂防治肾结石的作用机制，本研究以1%乙二醇和2%氯化铵为成石剂建立大鼠草酸钙肾结石模型，以枸橼酸钾为对照，观察排石冲剂对草酸钙结石大鼠体质量、尿草酸水平、生化指标及肾组织病理变化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级健康雄性Wistar大鼠由湖北省实验动物研究中心提供，48只，周龄8～9周，体质量80～100 g，实验动物使用许可证号:SCXK(鄂)2008-0005。

1.1.2 实验药物 排石冲剂由湖北省中医院制剂中心提供。组成:金钱草30 g、海金沙15 g、鸡内金15 g、王不留行子15 g、滑石15 g、生牡蛎10 g、冬葵子15 g、白芍15 g、甘草5 g、石韦20 g、川楝子15 g等。

1.1.3 实验试剂 乙二醇、氯化铵、枸橼酸钾均为分析纯。1%乙二醇 (批号20121206)、枸橼酸钾 (批号20120524)购自国药集团化学试剂有限公司;2%氯化铵 (批号20120612)购自天津永大化学试剂有限公司;冷冻切片冯库萨 (Von Kossa)钙染色试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建立草酸钙结石大鼠模型 参照参考文献 ［6-8］建立草酸钙结石大鼠模型，以1%乙二醇自由饮水和2%氯化铵溶液灌胃为成石剂，实验周期为4周。

1.2.2 分组与给药 大鼠适应性饲养1周后，采用随机数字表法分为4组，每组12只。正常组:给予0.9%氯化钠溶液灌胃，2 ml/d;模型组:给予成石剂，2 ml/d;枸橼酸钾组:给予成石剂及25%枸橼酸钾溶液灌胃，2 ml/d;排石冲剂组:给予成石剂及排石冲剂配成1.2 g/ml的混悬液灌胃，2 ml/d。各组大鼠均在相同条件下饲养。

1.2.3 标本收集及检测方法 各组实验结束时，将大鼠置于代谢笼，收集24 h尿液并计量，加防腐剂 (甲苯，用量1.0～2.0 ml甲苯/100 ml尿液)，4℃保存备用;大鼠称重后，10%水合氯醛按0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉，经腹主动脉血管采集血液标本，并置于临床用非抗凝血标本管，静置后，3 000 r/min离心10 min(离心半径3 cm)，留取淡黄色上清液(血清)备用;取左肾置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，作常规切片 (厚度为2 μm)。全自动德国罗氏生化分析仪测定血尿中Ca2+、Mg2+、P3+水平及血清中BUN、Cr水平，高效液相色谱法测定尿草酸水平。

1.2.4 肾脏结晶沉淀及病理检测 石蜡切片分别做HE染色和Von Kossa染色。每只大鼠选取5张切片，于每张切片肾皮质处随机选择5个视野，观察草酸钙结晶，以每个视野的平均值来表示该片的结晶，按形态分级评分法进行评分［9］:0分=无结晶;1分=有散在的结晶亮点;2分=广泛的不成堆或局限结晶;3分=有成堆结晶散在不连接;4分=结晶成堆且互相连接;5分=广泛成堆结晶，连接成片。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，计量资料以 (±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，结晶评分组间比较采用Kruskal-Wallis检验，两两比较采用Nemenyi检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 排石冲剂对草酸钙结石大鼠存活情况、体质量变化及尿量的影响 实验过程中，各组大鼠均无死亡，模型组第4周时大鼠出现食欲减退，毛发不荣，饮水减少，尿量减少，精神倦怠，身体蜷缩。而枸橼酸钾组和排石冲剂组大鼠，尿量增加，精神状况良好，饮食活动基本正常，排石冲剂组疗效更为明显。

4组大鼠体质量比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)。4组大鼠24 h尿量比较，差异有统计学意义 (P＜0.01);枸橼酸钾组和排石冲剂组均高于正常组和模型组，差异有统计学意义 (P＜0.05);枸橼酸钾组与排石冲剂组比较，差异无统计学意义 (P＞0.05，见表1)。

表1 各组大鼠体质量及24 h尿量比较 (±s)Table 1 Comparison of weight and 24 h urine volume in each group of rats

表1 各组大鼠体质量及24 h尿量比较 (±s)Table 1 Comparison of weight and 24 h urine volume in each group of rats

注:与正常组比较*P＜0.05;与模型组比较△P＜0.05

组别 只数 体质量(g) 24 h尿量(ml)12 141 ±14 15.1 ±0.8模型组 12 129±21 14.3±8.2枸橼酸钾组 12 132±16 20.3±6.4＊△排石冲剂组 12 138±16 22.3±5.7＊△F正常组1.37 5.17 P值值0.26 ＜0.01

2.2 排石冲剂对草酸钙结石大鼠血尿草酸及尿生化指标的影响 4组大鼠尿草酸及尿Ca2+、P3+、Mg2+水平比较，差异有统计学意义 (P＜0.01);4组大鼠尿草酸、Ca2+、P3+水平两两比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05);模型组、枸橼酸钾组与排石冲剂组大鼠尿Mg2+水平均低于正常组，差异有统计学意义 (P＜0.05);枸橼酸钾组与排石冲剂组大鼠尿Mg2+水平高于模型组，差异有统计学意义 (P＜0.05);枸橼酸钾组大鼠尿Mg2+水平与排石冲剂组比较，差异无统计学意义(P＞0.05，见表2)。

2.3 大鼠血清生化指标比较 4组大鼠血清Mg2+和P3+水平比较，差异无统计学意义 (P＞0.05);4组大鼠血清BUN、Cr和Ca2+水平比较，差异有统计学意义 (P＜0.01);枸橼酸钾组与排石冲剂组BUN、Ca2+水平均高于正常组，均低于模型组，差异有统计学意义 (P＜0.05);枸橼酸钾组与排石冲剂组BUN、Ca2+水平比较，差异无统计学意义 (P＞0.05);4组大鼠Cr水平两两比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05，见表3)。

2.4 排石冲剂对肾结石大鼠肾脏病理的影响 肉眼观察肾脏标本:正常组肾脏表面色泽均匀，组织结构清晰，切面鲜红色;模型组肾脏表面色泽暗淡，明显肿胀，有突出并散在分布的颗粒物，切面中心发白;枸橼酸钾组肾脏表面色泽稍暗，有肿胀，切面中心发白;排石冲剂组肾脏表面颜色正常，切面中心颜色稍淡。

光学显微镜下观察草酸钙结晶，常规HE染色为透明淡黄色晶体，Von Kossa's染色中晶体呈黑褐色。正常组大鼠肾皮质、髓质无结晶形成，细胞排列整齐、规则、结构清晰，肾小管腔内无沉积物，上皮细胞无肿胀充血，肾乳头、肾盂及肾盏清晰;造模组大鼠肾脏可见大量的草酸钙结晶形成，以肾皮质内多见，结晶成堆分布相互连接，肾小管管腔扩张明显。枸橼酸钾组大鼠肾脏亦可见较多草酸钙结晶，散在分布，肾小管有不同程度的扩张;排石冲剂组大鼠肾脏少量草酸钙结晶，零星散在分布，少数肾小管有不同程度的扩张 (见图1)。

2.5 各组大鼠肾组织中结晶形成情况 4组间结晶评分比较，差异有统计学意义 (H=7.714，P=0.005);其中，枸橼酸钾组和排石冲剂组草酸钙结晶评分高于正常组，低于模型组，差异均有统计学意义 (P＜0.05);排石冲剂组低于枸橼酸钾组，差异有统计学意义 (P＜0.05，见图2)。

表2 各组大鼠尿草酸及尿生化指标比较 (±s)Table 2 Comparison of urinary oxalate and urinary parameters in each group of rats

表2 各组大鼠尿草酸及尿生化指标比较 (±s)Table 2 Comparison of urinary oxalate and urinary parameters in each group of rats

注:与正常组比较，*P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05;与枸橼酸钾组比较，▲P＜0.05

组别 只数 尿草酸(mmol/24 h) Ca2+(mmol/L) P3+(mmol/L) Mg2+(mmol/L)正常组 12 20.80 ±2.54 0.25 ±0.03 10.05 ±2.27 0.93 ±0.08模型组 12 79.84 ±5.87* 0.78 ±0.05* 25.67 ±1.74* 0.53 ±0.05*枸橼酸钾组 12 40.80±3.78＊△ 0.53±0.06＊△ 21.43±1.87＊△ 0.71±0.03＊△排石冲剂组 12 32.75±2.44＊△▲ 0.41±0.04＊△▲ 15.15±2.17＊△▲ 0.75±0.06＊△F＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 512.50 278.50 138.60 96.48 P值值

表3 各组大鼠血清生化指标比较 (±s)Table 3 Comparison of serum biochemical parameters in each group of rats

表3 各组大鼠血清生化指标比较 (±s)Table 3 Comparison of serum biochemical parameters in each group of rats

注:与正常组比较，*P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05;与枸橼酸钾组比较，▲P＜0.05

组别 只数 BUN(mmol/L) Cr(μmol/L) Ca2+(mmol/L) Mg2+(mmol/L) P3+(mmol/L)2.97 ±0.12模型组 12 12.54 ±1.63* 52.24 ±10.03* 2.26 ±0.37* 1.03 ±0.32 3.27 ±0.28枸橼酸钾组 12 9.38 ±0.78＊△ 45.25± 1.32＊△ 1.84±0.32＊△ 1.35 ±0.76 3.12±0.15排石冲剂组 12 8.25 ±0.64＊△ 41.28± 1.43＊△▲ 1.78±0.35＊△ 1.65 ±0.67 3.08±0.13 F正常组 12 6.34 ±0.74 30.18 ± 1.83 1.68 ±0.35 1.45 ±0.78＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.15 0.34 76.73 37.97 6.46 1.84 1.59 P值值

图1 光学显微镜观察各组大鼠肾组织切片Figure 1 Morphological changes in kidney sections with HE and Von Kossa's staining

图2 各组肾组织草酸钙结晶评分Figure 2 Scores of the renal calcium oxalate crystallization

3 讨论

尿路结石是最为常见的疾病之一。草酸钙结石或含有草酸钙成分的结石是尿路结石中最常见的结石种类，约占80%［10］，故在动物实验研究中多以建立草酸钙结石大鼠为模型。乙二醇法是建立草酸钙结石动物模型的常用方法，也是新药评审中规定选用的方法之一，其建立模型的原理是乙二醇作为草酸形成的前体摄入可增加草酸合成，促进草酸钙形成;氯化铵可导致肾小管上皮损害［11-12］，有利于结晶的滞留和生长，可以缩短乙二醇造模的时间。前期参照相关文献［13-15］，本研究比较了不同方法对大鼠草酸钙结石生成的干预效果。中医学认为尿路结石属于“石淋”“砂淋”“腰痛”等范畴，其病机为湿热蕴结下焦，肾与膀胱气化不利，日久煎熬尿液为石，正如《丹溪心法》中“诸淋所发，皆肾虚而膀胱湿热也。肾主水，水结则化为石，肾虚而膀胱气化不行，为热所乘，热则成淋”。故治疗当清热利湿，排石通淋。排石冲剂是巴元明教授在辨病与辨证相结合的基础上，根据尿路结石的发病特点，结合全国知名肾脏病老中医邵朝弟教授临床经验，研制开发出一种以清热利湿活血法治疗尿路结石的新型纯中药制剂。前期临床试验表明:排石冲剂治疗尿路结石有显著的疗效，总有效率达86%，且能有效提高结石排出率，缩短结石排出时间，改善临床症状及阳性体征［16］。尽管如此，排石冲剂对尿路结石的防治作用尚需进一步阐明。

在临床上，尿路结石患者多出现尿中Ca2+、草酸盐、无机磷等排出增加，且常伴有血清Ca2+、草酸盐的增加［15］。研究表明，大鼠尿中Ca2+与草酸水平较高是泌尿系结石形成所需要的［17］。草酸钙结晶大量沉积于肾小管中，结晶可导致肾组织发生损伤，出现肾充血水肿，大量炎性细胞浸润，对肾小管的重吸收功能和肾小球滤过功能产生严重影响［18］。草酸不仅以草酸钙结晶的形式参与结石的形成，而且高浓度的草酸、草酸钙晶体会激活细胞内相关信号通路，诱导肾小管上皮细胞氧化应激及炎症损伤，损伤的肾上皮细胞为结石晶体的黏附提供了条件，同时产生的细胞碎片促进草酸钙结晶的核化和聚集。

对于草酸钙结石治疗的研究，现代医学多采用RAS抑制剂［19-20］、抗氧化剂［21-22］等药物干预草酸钙结石的形成过程，从而达到治疗草酸钙结石的效果。中医药治疗草酸钙结石的研究，多采用单味中药提取物，如五倍子鞣质［23］、金钱草黄酮提取物［9］、芦根提取液［24］等干预草酸钙结石的形成。本实验采用纯中药制剂干预草酸钙结石大鼠，观察中药复方治疗草酸钙结石大鼠的疗效，从而探讨中药制剂排石冲剂对大鼠草酸钙结石生成的干预效果及其机制。

本实验的模型组大鼠尿草酸、Ca2+、P3+及血清Ca2+、P3+水平明显高于正常组，且与肾组织病理切片观察到的结果相一致，可见此方法制作草酸钙结石大鼠模型是成功的。通过观察大鼠一般情况、血尿生化指标及尿草酸水平，可以发现:排石冲剂组及枸橼酸钾组大鼠血清BUN、Cr较模型组均降低，且排石冲剂组虽较正常组偏高但更接近正常，说明排石冲剂具有改善肾功能的作用;同时，排石冲剂组及枸橼酸钾组24 h尿草酸及血尿Ca2+、P3+水平较模型组减少，说明排石冲剂能通过降低血Ca2+、P3+和促进尿酸排泄起到防治结石的作用。大鼠肾组织病理切片结果显示，排石冲剂组草酸钙结晶数量明显减少，草酸钙结晶在肾脏的沉积面积明显缩小，肾小管水肿明显改善，说明其有一定的溶石、排石或促进结石排出的作用。

综上所述，排石冲剂能增加大鼠尿量，降低血尿Ca2+、P3+水平和促进尿草酸排泄，同时能改善肾功能，减少肾组织中草酸钙结晶，改善肾组织水肿，从而达到促进结石排出，保护肾脏结构，抑制结石形成的作用，表明排石冲剂对尿路结石具有防治作用，为排石冲剂治疗尿路结石的临床运用提供必要的实验依据。而排石冲剂防治草酸钙结石的功效与RAS的激活和抗氧化应激等是否存在关联，还有待于进一步研究。

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