辅酶Q10对1-甲基-4-苯基吡啶帕金森病大鼠的干预作用及其机制研究

高俊鹏，周子懿，向 军，陈依萍，罗恩丽，蔡定芳

同行评议:

诸多研究提示辅酶Q10(CoQ10)可以对帕金森病 (PD)动物模型起到神经保护作用，然而，最近的多中心随机双盲临床试验却未能得出阳性结果。为揭示这一现象的可能原因，本研究分别采用CoQ10预防性与治疗性给药的方式对1-甲基-4-苯基吡啶 (MPP+)-PD大鼠模型进行干预，结果提示，CoQ10预防性给药可以改善PD大鼠的运动功能，减少多巴胺神经元的死亡，而CoQ10治疗性给药则无效。由此提出了CoQ10应在PD病程早期给药，对于PD发病高危人群则应预防性给药的新观点。本研究结果从给药时间窗角度解释了CoQ10在临床研究中未能得到阳性结果的原因，同时对后续临床研究与应用起到一定指引作用。

帕金森病 (Parkinson's disease，PD)是常见的中枢神经系统退行性疾病，其病理特征为黑质多巴胺(dopamine，DA)神经元进行性变性。现有治疗方法虽然可以部分缓解患者的症状，但仍无有效方法阻止DA神经元的变性过程。线粒体酶复合体Ⅰ (ComplexⅠ)活性的降低是导致PD发生的重要环节。在对PD患者和PD模型的研究中，均发现ComplexⅠ功能的下降［1］，线粒体膜及线粒体DNA受到破坏，致使能量合成障碍，大量自由基生成，损伤DA神经元［2］。

辅酶Q10(CoQ10)是线粒体电子传递链重要组分之一，在ATP生成以及减少自由基的产生方面发挥关键作用。因而，补充外源性CoQ10可能是PD治疗策略之一。动物研究发现，口服CoQ10能够对多种PD模型产生神经保护作用［3-4］。荟萃分析亦显示，CoQ10对PD有潜在的神经保护作用［5］。然而Cornell大学领衔PD研究团队随后开展了更高剂量CoQ10治疗早期PD患者的多中心、随机、双盲Ⅲ期临床试验，结果显示，不论是1 200 mg/d或2 400 mg/d的CoQ10，均未能给患者带来益处［6］。这可能是因为PD患者症状明显时，其黑质纹状体系统DA神经元已经减少了60%～80%所致。因此，笔者提出了CoQ10应提早给药的观点。本研究拟利用1-甲基-4-苯基吡啶 (MPP+)-PD大鼠模型，观察CoQ10预防性用药与治疗性用药对PD模型大鼠的干预效果，并从线粒体功能的角度探讨其可能的机制，以期为CoQ10治疗PD的用药时间窗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料及分组 选取清洁级标准健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，体质量250～280 g。由复旦大学实验动物中心提供，并饲养于该实验动物中心，自由进食、饮水。动物房12 h/12 h光暗交替，平均温度22℃，相对湿度30%。按照国际实验动物使用准则［7］对动物进行操作，以减少实验动物在实验过程中的痛苦。采用完全随机设计将大鼠均分为4组，假手术组、模型组、CoQ10预防性给药组、CoQ10治疗性给药组，各12只。

1.2 试剂与药品 MPP+(Sigma公司，D048)，阿朴吗啡 (Sigma公司，A4393)，CoQ10(上海信宜制药厂有限公司)、10%驴血清 (Sigma，D9663)，抗酪氨酸羟化酶 (TH)抗体 (Sigma公司，T8700)，抗OX-42抗体 (Chemicon公司，CBL1512)，磷酸盐缓冲液(PBS)。

1.3 方法

1.3.1 建立MPP+-PD大鼠模型及假手术组处理方法 大鼠予苯巴比妥麻醉，缓慢将2 μl MPP+(10 μg)以0.4 μl/min速度通过鼠脑立体定位仪注射入左侧黑质致密部。注射完毕待大鼠清醒后将大鼠置动物房继续饲养，2周后以阿朴吗啡0.25 mg/kg作为行为学鉴定，进行旋转试验，诱发大鼠旋转，计数注药1 h大鼠右侧净旋转数，＞300转为造模成功。假手术组以等量0.9%氯化钠溶液代替MPP+，其余步骤同上。

1.3.2 给药方法 CoQ10以饲料混合方式给药［8］，将CoQ10与大鼠全价营养饲料混合，制备成CoQ10含量为0.2%的饲料，取代大鼠全价营养饲料进行喂养。CoQ10预防性给药组大鼠在造模前第9天开始给予含CoQ10饲料，造模后次日改回全价营养饲料，即连续给予CoQ10饮食10 d。CoQ10治疗性给药组大鼠在造模后次日开始给予CoQ10饲料，连续给予10 d。

1.3.3 行为学评价 阿朴吗啡诱导旋转试验、前肢跨步运动试验、触须引发不对称放置试验是评定偏侧PD大鼠黑质纹状体系统损害程度的常用行为学指标［9-10］，前肢跨步运动试验、触须引发不对称放置试验得分越高表示运动功能损害越严重。本研究分别于造模第0、1、3、7、14、21天时评价各组大鼠的行为学表现并进行比较。

1.3.3.1 阿朴吗啡诱导旋转试验 在各观察时间点皮下注射阿朴吗啡，剂量为0.3 mg/kg，诱发其旋转行为，旋转360°为一转，记录大鼠30 min内的旋转转数。

1.3.3.2 前肢跨步运动试验 握住大鼠躯干，用手指固定并抬起一侧前肢，同时轻微提起大鼠躯干的后半部，使另一侧前肢着地，产生跨步运动，每侧肢体检测10 s，两侧轮换。计算损伤同侧不对称指数 (损伤同侧跨步次数/损伤同侧对侧次数和-损伤对侧跨步次数/损伤同侧对侧次数和)。

1.3.3.3 触须引发不对称放置试验 握住大鼠躯干并离开地面，将其一侧触须触碰桌角。当大鼠一侧触须触碰桌角时可诱发同侧前肢向桌角的放置动作，受损前肢常不能将前肢成功放置于桌角。评分时，两侧前肢分别试验10次，计算不成功放置的比例 (损伤对侧前肢不成功放置次数/损伤同侧前肢不成功放置次数)×10。

1.4 免疫荧光组化染色与定量分析

1.4.1 组织切片 大鼠在乌拉坦深度麻醉下，利用4%多聚甲醛灌注固定取脑，按常规方法用冷冻切片机做大脑冠状面连续切片，漂片备用。

1.4.2 TH与小胶质细胞特异表达补体 C3受体(OX-42)免疫荧光组化染色 以TH标记DA神经元，OX-42标记小胶质细胞。染色方法如下:(1)从漂片器皿中挑取脑薄片，每只大鼠挑取6张。(2)PBS漂洗后，用10%驴血清封闭，4℃过夜。 (3)一抗:兔抗TH或鼠抗OX-42抗体，4℃孵育40 h。(4)PBS漂洗3次，10 min/次。 (5)二抗:罗丹明偶联的驴抗兔IgG，避光室温下孵育90 min。(6)PBS漂洗3次，10 min/次，避光。(7)封片后置于激光共聚焦显微镜下观察。

1.4.3 免疫荧光组化染色结果的观察与分析 经免疫荧光组化染色处理后的切片置于激光共聚焦显微镜下观察，使用10倍和40倍物镜。用Leica Qwin 500图像分析软件对黑质区域进行观察，测定OX-42免疫荧光强度，结果以平均光密度值表示。计算DA神经元存活率，以MPP+注射同侧TH阳性神经元数量与对侧的比值表示。

1.4.4 ComplexⅠ活性的测定 参考文献 ［8］取中脑组织，将线粒体蛋白于测定前置于20℃/-20℃反复冻融3次，使之成为线粒体膜片段以进行线粒体呼吸链ComplexⅠ活性测定。将10 μg线粒体蛋白加入到ComplexⅠ反应缓冲液中 (KCl 110 mmol/L，KH2PO45 mmol/L，MgCl21 mmol/L，Tris-HCl 20 mmol/L，NaN33 mmol/L，抗毒素 A 1 mg/L，CoQ1060 μmol/L)混匀，37℃孵育3 min加入30～50 μg线粒体蛋白启动反应，1 min内连续测定A340值的变化，根据1 min A340值的变化反映ComplexⅠ的活性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析，正态分布计量资料以 (±s)表示，4组免疫荧光组化染色结果和ComplexⅠ活性的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用SNK-q检验;4组不同时间行为学得分比较采用两变量双因素重复测量方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4 组大鼠不同时间行为学得分比较 4组大鼠不同时间点阿朴吗啡诱导旋转试验转数比较，差异有统计学意义 (F交互=22.299，P＜ 0.01;F时间=132.494，P＜0.01;F组间=99.994，P＜0.01，见图1A);4 组大鼠不同时间点前肢跨步运动试验得分比较，差异有统计学意义 (F交互=10.622，P＜ 0.01;F时间=107.880，P＜0.01;F组间=45.621，P＜0.01，见图 1B);4 组大鼠不同时间点触须引发不对称放置试验得分比较，差异有统计学意义 (F交互=8.281，P＜0.05;F时间=120.000，P＜0.01;F组间=40.200，P＜0.01，见图1C)。

2.2 4 组大鼠OX-42免疫荧光强度和DA神经元存活率比较 在假手术组大鼠中脑黑质部位，OX-42免疫荧光强度较低。在MPP+造模后第21天，红色标记DA神经元的特异抗体，用绿色标记小胶质细胞的特异抗体OX-42。在模型组大鼠中脑黑质部位，OX-42免疫荧光组化染色较深，免疫荧光强度较高 (见图2)。4组OX-42免疫荧光强度比较，差异有统计学意义 (F=7.460，P＜0.01);模型组、CoQ10预防性给药组、CoQ10治疗性给药组OX-42免疫荧光强度高于假手术组，差异有统计学意义 (P＜0.01，见图3)。4组DA神经元存活率比较，差异有统计学意义 (F=229.757，P＜0.01)。CoQ10预防性给药组大鼠DA神经元存活率高于模型组，差异有统计学意义 (q=9.136，P＜0.01，见图4)。

2.3 4 组大鼠ComplexⅠ活性比较 假手术组、模型组、CoQ10预防性给药组、CoQ10治疗性给药组大鼠的ComplexⅠ活性分别为 (174.3 ± 27.2)、 (93.5 ±17.0)、(151.3 ±21.9)、(116.2 ±19.6)，差异有统计学意义 (F=16.395，P＜ 0.01)。CoQ10预 防 性 给 药 组 大 鼠ComplexⅠ活性高于模型组，差异有统计学意义 (q=6.507，P＜0.01);而CoQ10治疗性给药组大鼠与模型组ComplexⅠ活性比较，差异无统计学意义 (q=2.550，P＞0.05)。

3 讨论

近年来，PD的早期治疗正受到越来越多的关注［11］。对该病10年的临床观察表明，第1年统一PD评分量表 (UPDRS)评分上升尤为迅速，而后9年则维持相对稳定［12］。病理结果显示，相对于晚期PD而言，早期患者黑质致密部DA神经元的死亡速度表现为非完全线性急剧上升［13］，均提示PD早期病情发展较快。因此，在PD病程的早期甚至临床前期进行积极的神经保护治疗显得尤为必要。

PD患者DA神经元线粒体中CoQ10含量显著低于正常人，有学者认为CoQ10异常可能是患者线粒体障碍的原因，CoQ10作为线粒体中的重要辅酶，在线粒体呼吸链中起传递质子及电子的作用，是重要的天然抗氧化剂和特异性免疫增强剂［14］。外源性CoQ10通过保护线粒体膜和嵴，保持线粒体结构完整而维持其氧化磷酸化功能减少自由基生成，并抑制磷脂酶A2对细胞膜磷脂的分散，对生物膜起保护和稳定作用。

图1 4组大鼠不同时间行为学得分比较Figure 1 Comparison of behavioral performance among the four groups

图2 4组大鼠OX-42免疫荧光强度和DA神经元免疫荧光组化染色结果Figure 2 Immunohistochemicalphotomicrographs showing OX-42 immunointensity and DA neurons among the four groups

图3 各组OX-42免疫荧光强度比较Figure 3 Comparison of the immunofluorescence intensity of OX-42 in each group

图4 各组DA神经元存活率比较Figure 4 Comparison of the survial ratio of DA neurons in each group

在本研究中，CoQ10预防性给药组大鼠各时间点行为学表现优于模型组，CoQ10预防性给药组OX-42免疫荧光强度高于假手术组，CoQ10预防性给药组大鼠DA神经元存活率高于模型组，提示CoQ10预防性给药能减轻PD大鼠行为学异常，提高DA神经元存活率。本研究还发现，CoQ10预防性给药组大鼠ComplexⅠ活性高于模型组，提示CoQ10预防性给药可使线粒体ComplexⅠ的活性增高，造模后给药则无此作用。其原因可能为线粒体ComplexⅠ功能的改善需要一个长期过程，需在CoQ10作用数天后才能完成。若CoQ10在MPP+注射后开始给药，那么在ComplexⅠ功能增强之前，DA神经元就已经因线粒体功能的下降而变性死亡，因此无法起到对DA神经元保护和行为学改善效果。

本研究对预防性与治疗性给予线粒体功能增强剂CoQ10的效果进行比较，结果提示，CoQ10预防性给药可以通过阻止PD大鼠线粒体ComplexⅠ活性的下降，延缓DA神经元衰退过程，减慢PD症状进行性发展的速度，进一步印证了PD病程早期干预的重要性。临床上，对于PD发病高危人群，如长期暴露于鱼藤酮等农药或曾接触1-甲基 -4-苯基 -1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)等毒素，尤其有PD家族史的人群，笔者认为预防性服用CoQ10可能延缓PD的发病过程。

本研究也存在一定局限性。目前认为，PD的发病机制包括线粒体功能异常、炎性反应、氧化应激等［15］。本研究仅从线粒体角度探讨了CoQ10的可能机制，未能涵盖其他PD发病机制。后续研究可以针对多种发病机制对PD模型进行联合给药，以期探索出更为优化的治疗策略。

综上所述，以线粒体ComplexⅠ为靶点预防性给予CoQ10进行干预可以改善PD模型的运动功能，减少DA神经元的死亡。对于PD患者而言，在其发病初期尽早给予CoQ10可能是其取得疗效的关键，这就为后续线粒体功能增强剂的临床研究提供了新的理论依据。

［1］ GautierCA， CortiO， Brice A.Mitochondrialdysfunctionsin Parkinson's disease ［J］.Rev Neurol，2014，170(5):339-343.

［2］ Schapira AH.Mitochondria in the aetiology and pathogenesis of Parkinson's disease［J］.Lancet Neurol，2008，7(1):97-109.

［3］ Muthukumaran K，Leahy S，Harrison K，et al.Orally delivered water soluble Coenzyme Q10(Ubisol- Q10)blocks on - going neurodegeneration in rats exposed to paraquat:potential for therapeutic application in Parkinson's disease［J］.BMC Neuroscience，2014，15:21.

［4］ Spindler M，Beal MF，Henchcliffe C.Coenzyme Q10effects in neurodegenerative disease［J］.Neuropsychiatr Dis Treat，2009，5:597-610.

［5］ Liu J，Wang LN.Mitochondrial enhancement for neurodegenerative movement disorders:a systematic review of trials involving creatine，coenzyme Q10，idebenone and mitoquinone［J］.CNS Drugs，2014，28(1):63-68.

［6］ Parkinson Study Group QE3 Investigators，Beal MF，Oakes D，et al.A randomized clinical trial of high-dosage coenzyme Q10in early Parkinson disease:no evidence of benefit［J］.JAMA Neurology，2014，71(5):543-552.

［7］ National Research Council(US)Institute for Laboratory Animal Research.Guide for the care and use of laboratory animals［M］.Washington(DC):National Academies Press(US)，1996.

［8］ Mildaziene V，Nauciene Z，Baniene R，et al.Multiple effects of 2，2'，5，5'-tetrachlorobiphenyl on oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria［J］.Toxicol Sci，2002，65(2):220-227.

［9］ Truong L，Allbutt H，Kassiou M，et al.Developing a preclinical model of Parkinson's disease:a study of behaviour in rats with graded 6-OHDA lesions［J］.Behav Brain Res，2006，169(1):1-9.

［10］ Tillerson JL，Cohen AD，Philhower J，et al.Forced limb-use effects on the behavioraland neurochemicaleffects of6 -hydroxydopamine［J］.Journal of Neuroscience，2001，21(12):4427-4435.

［11］ Worth PF.How to treat Parkinson's disease in 2013［J］.Clin Med，2013，13(1):93-96.

［12］ Poewe W.The need for neuroprotective therapies in Parkinzon's disease:a clinical perspective［J］.Neurology，2006，66(Suppl 4):s2-9.

［13］ Fearnley JM，Lees AJ.Ageing and Parkinson's disease:substantia nigra regional selectivity［J］.Brain，1991，114:2283-2301.

［14］ Salama M，Yuan TF，Machado S，et al.Co-enzyme Q10to treat neurological disorders:basic mechanisms，clinical outcomes，and future research direction ［J］.CNS Neurol Disord Drug Targets，2013，12(5):641-664.

［15］ Dexter DT，Jenner P.Parkinson disease:from pathology to molecular disease mechanisms［J］.Free Radic Biol Med，2013，62:132-144.