藏雪莲水提取物对中波红斑效应紫外线辐射人角质形成细胞抗氧化作用的研究

郭 砚，孙 娟，王丽雯

本研究创新点:

藏雪莲是高原地区传统的珍贵藏药，被藏族人民视为“圣药”。本研究依据青海省高海拔、强紫外线和缺氧的地理环境，且其居住人群长期暴露于强紫外线环境，易导致皮肤光老化，以人角质形成细胞 (HaCaT细胞)作为研究对象，采用台盼蓝染色观察细胞形态及死亡情况，MTS比色法检测细胞增殖情况，酶标法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽 (GSH)含量、丙二醛(MDA)含量、过氧化氢酶 (CAT)活力，探讨藏雪莲水提取物对中波红斑效应紫外线 (UVB)所引起的HaCaT细胞光老化的保护作用，为青藏高原药材的开发和实际应用提供理论依据，同时为藏雪莲光保护作用机制提供理论基础。

皮肤老化是人体衰老的一个重要表现，皮肤老化分为两种:一种是固有性老化，一种是由环境因素，如紫外线、吸烟、风吹等引起的外源性老化。皮肤每天均接受来自日光中紫外线的辐射，长期的紫外线辐射导致皮肤发生形态学、组织学和生理学的改变，称之为光老化。阳光中紫外线分为3种:长波黑斑效应紫外线(UVA)(320～400 nm)、中波红斑效应紫外线 (UVB)(280～319 nm)、短波灭菌紫外线 (UVC)(100～279 nm)，UVB是引起辐射损伤的最重要因素，主要损伤皮肤角质形成细胞 (HaCaT细胞)，增加皮肤组织中活性氧 (ROS)的生成量，进而产生超氧阴离子，使细胞内的过氧化氢 (H2O2)大量增多，H2O2分解产生大量自由基，引起一系列的氧化损伤［1］，诱导皮肤光老化的发生。藏雪莲属菊科凤毛菊属雪莲亚属的草本植物，又名雪莲花，是中国西部高山特有的多年生草本植物，具有除湿散寒、通筋活血、强筋助阳的功效，民间多用于治疗风湿性关节炎、妇女小腹冷痛、胎衣不下、闭经、麻痹不透、肺寒咳嗽、高山不适应症等治疗［2］，且有研究证实，藏雪莲水提取物能够增加小白鼠组织内超氧化物歧化酶 (SOD)活力［3］、增加谷胱甘肽 (GSH)含量［4］、降低丙二醛 (MDA)含量［3，5］，从而发挥抗氧化作用。但藏雪莲水提取物对UVB辐射HaCaT细胞抗氧化损伤作用尚未见报道。故本研究主要探讨藏雪莲水提取物对UVB诱导的HaCaT细胞抗氧化损伤作用，为藏雪莲水提取物对UVB光保护作用研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器 藏雪莲购自青海众康医药连锁有限公司，HaCaT细胞购自南京凯基生物科技发展有限公司;10%胎牛血清 (FBS)购自Biological Industries，DMEM培养基购自赛默飞世尔生物化学制品 (北京)有限公司，胰酶购自Solarbio公司，台盼蓝染色液购自美国Sigma生物公司，MTS购自Promega公司，SOD测试盒、GSH测试盒、MDA测试盒、过氧化氢酶 (CAT)测试盒均购自南京建成生物工程研究所;二氧化碳(CO2)培养箱购自上海力申科学仪器有限公司，IX71型Olympus倒置显微镜购自Olympus公司，飞利浦TL20W/12紫外线UVB灯管购自上海杰图商贸有限公司，UV-340A UVB辐照度监视器购自北京精密仪器科技有限公司，X-Mark型BIO-RAD酶标仪购自BIORAD公司。

1.2 藏雪莲水提取物的制备 根据文献 ［3］，准确称取100 g藏雪莲 (经青海大学医学院药学系陈湘宏副教授鉴定)，加入蒸馏水浸泡过夜 (料液比为1∶5)，加热至100℃后，文火 (85℃)煎煮2 h，每隔15 min搅拌1次，过滤，滤渣加蒸馏水后继续煎煮，重复3次，过滤，合并滤液，冷冻干燥得藏雪莲水提取物。

1.3 HaCaT细胞的培养 根据文献 ［6］，HaCaT细胞以含10%FBS的DMEM为培养基 (内含10 U/ml青霉素和10 U/ml链霉素)，接种于培养瓶后，置于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱，当细胞达90%融合时用以传代，取3～5代对数生长期的细胞用于实验。

1.4 实验分组 当HaCaT细胞达到85% ～90%融合时，将培养瓶内的细胞按1×106ml细胞浓度转到96孔板或6孔板中继续培养。当细胞达80%～90%融合时，分为低剂量辐射组 (30 mJ/cm2，辐射1 h)、高剂量辐射组 (60 mJ/cm2，辐射1 h)，低剂量辐射组进一步分为对照组、L-UVB组、L-UVB+低剂量臧雪莲组 (臧雪莲 1 g/L)、L-UVB+高剂量臧雪莲组 (臧雪莲5 g/L)，高剂量辐射组进一步分为对照组、H-UVB组、H-UVB+低剂量臧雪莲组 (臧雪莲1 g/L)、H-UVB+高剂量臧雪莲组 (臧雪莲5 g/L)。UVB辐射前1 h将HaCaT细胞用无菌PBS洗涤3遍，并加入不同浓度藏雪莲水提取物于细胞培养基中，对照组用锡纸包住置暗处，其他组细胞打开培养皿盖在预设好的UVB辐射仪中照射1 h后，立即用无菌PBS洗涤3遍，并加含10%FBS的DMEM培养基继续培养18 h。

1.5 实验方法

1.5.1 台盼蓝染色 将经含10%FBS的DMEM培养基培养18 h后的96孔板，用无菌PBS洗涤3遍，各组细胞中每孔加入 0.4% 台盼蓝 50 μl，3 min，IX71 型Olympus倒置显微照相系统观察并摄片。

1.5.2 MTS比色法检测细胞增殖 将经含10%FBS的DMEM培养基培养18 h后的96孔板各孔加入MTS溶液20 μl，37℃，5%CO2培养箱继续孵育3 h。终止培养后，酶标仪上选择490 nm波长测定各孔吸光度(A)值。

1.5.3 SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力检测 选UVB辐射后损伤较轻组，按照南京建成生物工程研究所生产的测试盒说明书检测SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力。

1.6 统计学方法 采用Sigma Plot 10.0统计学软件进行数据分析，计数资料以 (±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 台盼蓝染色结果 倒置显微镜显示，UVB照射1 h后，L-UVB组与对照组比较，HaCaT细胞出现轻度肿胀、漂浮，但仍可看出细胞形态，且HaCaT细胞蓝染数量增加;L-UVB+低剂量臧雪莲组与L-UVB组比较，HaCaT细胞蓝色数量未下降，细胞仍有水肿现象，脱片现象仍存在，但可见正常细胞形态;L-UVB+高剂量臧雪莲组与L-UVB组比较，HaCaT细胞蓝色数量下降，细胞水肿程度减轻，并且L-UVB+高剂量臧雪莲组细胞形态接近对照组。H-UVB组与对照组比较，HaCaT细胞明显肿胀，并出现细胞死亡成碎片及脱片现象，且细胞形态已模糊不清;H-UVB+低剂量臧雪莲组和H-UVB+高剂量臧雪莲组与H-UVB组比较，HaCaT细胞依然明显肿胀，仍有细胞死亡成碎片及脱片现象，且细胞形态模糊不清 (见图1)。

图1 各组HaCaT细胞台盼蓝染色结果 (×10)Figure 1 Results of Trypan blue staining of HaCaT cells in each group

2.2 MTS比色法检测细胞增殖 对照组、L-UVB组、L-UVB+低剂量臧雪莲组、L-UVB+高剂量臧雪莲组A值比较，差异有统计学意义 (P＜0.05);其中L-UVB组A值较对照组降低，差异有统计学意义 (P＜0.05);L-UVB+低剂量臧雪莲组、L-UVB+高剂量臧雪莲组A值较L-UVB组升高，差异有统计学意义(P＜0.05，见表 1)。对照组、H-UVB组、H-UVB+低剂量臧雪莲组、H-UVB+高剂量臧雪莲组A值比较，差异有统计学意义 (P＜0.05);其中H-UVB组A值较对照组降低，差异有统计学意义 (P＜0.05);H-UVB+低剂量臧雪莲组、H-UVB+高剂量臧雪莲组A值较H-UVB组升高，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表 2)。

表1 低剂量辐射组MTS比色法检测A值比较 (±s)Table 1 Comparison of A value by MTS test among four subgroups ofL-UVB group

表1 低剂量辐射组MTS比色法检测A值比较 (±s)Table 1 Comparison of A value by MTS test among four subgroups ofL-UVB group

注:L-UVB=低剂量中波红斑效应紫外线，A值=吸光度;与对照组比较，*P ＜0.05;与L-UVB组比较，△P ＜0.05

组别 例数 A值对照组 5 2.15 ±0.14 L-UVB组 5 1.22 ±0.12*L-UVB+低剂量臧雪莲组 5 1.69 ±0.08△L-UVB+高剂量臧雪莲组 5 2.24 ±0.09△F 129.85 P值值＜0.001

表2 高剂量辐射组MTS比色法检测A值比较 (±s)Table 2 Comparison of A value by MTS test among four subgroups of H-VUB group

表2 高剂量辐射组MTS比色法检测A值比较 (±s)Table 2 Comparison of A value by MTS test among four subgroups of H-VUB group

注:H-UVB=高剂量中波红斑效应紫外线;与对照组比较，*P＜0.05;与H-UVB组比较，△P ＜0.05

组别 例数 A值对照组 5 2.16 ±0.05 H-UVB组 5 0.55 ±0.01*H-UVB+低剂量臧雪莲组 5 0.94 ±0.03△H-UVB+高剂量臧雪莲组 5 1.99 ±0.09△F 值＜0.001 912.81 P值

2.3 SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力检测结果 台盼蓝染色及MTS比色法结果显示，藏雪莲水提取物对H-UVB损伤的保护作用较弱，因此选用低剂量辐射组进行抗氧化损伤研究，对照组、L-UVB组、L-UVB+低剂量臧雪莲组、L-UVB+高剂量臧雪莲组SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力比较，差异有统计学意义 (P＜0.05);其中L-UVB组SOD活力、GSH含量、CAT活力较对照组降低，MDA含量较对照组升高，差异有统计学意义 (P＜0.05);L-UVB+低剂量臧雪莲组GSH含量较L-UVB组降低、MDA含量较L-UVB组升高，差异有统计学意义 (P＜0.05);L-UVB+高剂量臧雪莲组SOD活力、GSH含量、CAT活力较L-UVB组和L-UVB+低剂量臧雪莲组升高，MDA含量较L-UVB组和L-UVB+低剂量臧雪莲组降低，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表3)。

表3 低剂量辐射组SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力比较(±s)Table 3 Comparison of SOD activity，GSH content，MDA content andCAT acivity among four subgroups of L-UVB group

表3 低剂量辐射组SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力比较(±s)Table 3 Comparison of SOD activity，GSH content，MDA content andCAT acivity among four subgroups of L-UVB group

注:SOD=超氧化物歧化酶，GSH=谷胱甘肽，MDA=丙二醛，CAT=过氧化氢酶;与对照组比较，*P＜0.05;与L-UVB组比较，△P＜0.05;与L-UVB+低剂量臧雪莲组比较，▲P ＜0.05

组别 例数 SOD活力 GSH含量 MDA含量 CAT 5 21.26 ±0.66 6.84 ±0.14 3.85 ±1.36 25.00 ±3.05 L-UVB组 5 17.36 ±1.48* 4.55 ±0.21* 8.25 ±1.02* 8.40 ±0.94*活力对照组L-UVB+低剂量臧雪莲组 5 18.30±0.84 3.45±0.15△ 14.92 ±0.84△ 6.86±1.39 L-UVB+高剂量臧雪莲组 5 29.65±1.78△▲ 8.01±0.27△▲ 6.94 ±0.24△▲ 34.21±4.33△▲F 241.00 895.88 218.43 135.25 P值值＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

藏雪莲产于青藏高原海拔3 000～6 000 m雪山雪线碎石间，在藏医藏药上藏雪莲花作为药物已有悠久的历史，是藏族常用的一种民间药物，在藏族古代药物文献《月王药珍》《西部医典》《西北域记》《兰琉璃》《晶珠本草》及清代《本草纲目拾遗》中均有记载［7-8］。UVB可损伤HaCaT细胞，增加皮肤组织中ROS的生成量，激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，进而产生超氧阴离子，使细胞内的H2O2大量增多，H2O2分解产生大量自由基，引起一系列的氧化损伤［1，9-10］，进而诱导皮肤光老化。目前，藏雪莲水提取物在UVB诱导HaCaT细胞抗氧化损伤方面的作用未见报道。

本研究结果显示，低剂量辐射组HaCaT细胞经台盼蓝染色后出现轻度肿胀、漂浮，蓝染细胞数量增加，高剂量辐射组UVB对HaCaT细胞氧化损伤更严重，出现细胞死亡成碎片及脱片现象，细胞形态模糊不清，且无论是低剂量臧雪莲还是高剂量臧雪莲均不能减轻UVB对HaCaT细胞的氧化损伤，表现为给予藏雪莲水提取物后HaCaT细胞形态仍模糊不清，细胞明显肿胀，细胞死亡成碎片及脱片现象严重，而L-UVB+低剂量臧雪莲组细胞形态明显恢复，细胞蓝染数量亦明显下降，细胞死亡碎片及脱片现象明显改善;MTS比色法检测细胞增殖结果显示，L-UVB+低剂量臧雪莲组、L-UVB+高剂量臧雪莲组A值较L-UVB组升高，H-UVB+低剂量臧雪莲组、H-UVB+高剂量臧雪莲组A值较H-UVB组升高，说明藏雪莲水提取物能够促进HaCaT细胞在UVB损伤后的增殖。

本研究结果显示，L-UVB组SOD活力、GSH含量、CAT活力较对照组降低，MDA含量较对照组升高，与既往实验结果相似［3-5］。L-UVB+低剂量臧雪莲组GSH含量较L-UVB组降低、MDA含量较L-UVB组升高;L-UVB+高剂量臧雪莲组SOD活力、GSH含量、CAT活力较L-UVB组升高，MDA含量较L-UVB组降低;L-UVB+高剂量臧雪莲组SOD活力、GSH含量、CAT活力较L-UVB+低剂量臧雪莲组升高，MDA含量较L-UVB+低剂量臧雪莲组降低。说明L-UVB+低剂量臧雪莲不能减轻UVB辐射对HaCaT细胞造成的辐射损伤，而L-UVB+高剂量臧雪莲能够减轻UVB辐射对HaCaT细胞造成的辐射损伤。但结合MTS比色法检测结果可知L-UVB+低剂量臧雪莲可以促进UVB辐射后HaCaT细胞的增生，但却没有抗氧化保护作用，可能由于低剂量辐射组与HaCaT细胞孵育时间太短，但其原因有待进一步研究。

本研究阐述藏雪莲水提取物对UVB辐射后HaCaT细胞氧化损伤的保护作用，提出了低剂量藏雪莲水提取物与HaCaT细胞提前孵育1 h不能减轻UVB辐射后HaCaT细胞氧化损伤，而高剂量藏雪莲水提取物可以减轻氧化损伤，为进一步探讨藏雪莲水提取物在UVB的光保护作用的研究提供理论基础。

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