纤维乙醇发酵残渣中酶解木质素的提取与表征

潘奇，陈介南，张新民，詹鹏，张林

（1 中南林业科技大学国家林业局生物乙醇研究中心，湖南 长沙 410004；2 中南林业科技大学材料科学与工程学院，湖南 长沙 410004）

生物乙醇是一种燃烧热值大、CO2排放量低的可再生燃料，与汽油或柴油以一定比例混合使用，不仅节约了不可再生能源，而且改善了燃烧过程，降低了有害物质的生产和排放，对生物乙醇的研究正日益受到广泛关注[1]。利用木质纤维这种丰富廉价的“非粮”原料酶解发酵生产乙醇是解决能源匮乏的重要途径，被称为“第二代”生物乙醇，但是由于木质纤维结构复杂，酶解发酵技术仍需不断完善，而且生产成本较高等问题，导致木质纤维生产生物乙醇一直没有实现商业化生产。研究表明，发酵残渣中除含有未酶解的纤维素、半纤维素和其他杂质外，还含有大量的木质素[2]，木质素化学活性较高，对其进行化学改性后的产品，已经广泛应用于胶黏剂[3-5]、表面活性剂[6-7]、减水剂[8-9]等工业领域，在农业方面的应用潜力也十分广阔，如复合缓释肥料、农药缓释剂等在农业中的用量也很大。木质纤维酶解发酵生产生物乙醇过程中的残渣通常被直接焚烧充当燃料，不仅经济效益不高，而且对环境造成了一定的污染，对这些木质素进行回收利用将提高木质纤维转化生物乙醇工业的经济效益，对促进纤维乙醇工业的发展有重大意义。

木质素的分离方法主要有酸法、碱法、有机溶剂法，不同的分离方法分离的木质素结构有所差异。酸法是利用一定浓度的酸性溶液降解纤维素和半纤维素，从而分离得到酸不溶木质素，酸可以是有机酸或者无机酸，Klason 法是常用的测定与分离木质素的方法；碱法提取木质素的原理是木质素含有大量酚羟基，呈弱酸性，不溶于水，在碱溶液中形成木质素复合物而溶解，用酸作为沉淀絮凝剂，析出木质素，从而分离出木质素[10]；有机溶剂法是利用有机溶剂溶解木质素，经过沉淀，回收溶剂，分离得到木质素，不同有机溶剂分离得到的木质素结构有所差异[11-13]。

本工作采用一般碱法对发酵残渣中的酶解木质素进行分离，研究了碱浓度、料液比、反应温度、反应时间各因素对木质素提取效果的影响，通过正交试验优化了提取条件，并对提取出的木质素结构进行表征，以期为酶解木质素进一步改性应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

杨木纤维乙醇发酵残渣由国家林业局生物乙醇研究中心提供，其他试剂均为市售分析纯。FZ102型微型植物粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；Eppendorf AG 22331 型高速离心机，德国艾本德公司；JA2003 电子天平，上海恒平科学仪器有限公司；UV-2450 型紫外可见光分光光度计，岛津公司；FT-IR-8400s 型红外光谱仪，岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理

蜡、脂肪、树脂、色素等物质容易与木质素形成缩合物，从而被一起分离出来。甲苯具有溶解树脂、蜡、脂肪等的能力，乙醇又能溶出树脂、单宁酸、色素、部分碳水化合物和微量的木质素，所以用苯醇混合物对原料进行抽提，将这些杂质除 去[14]。

将杨木纤维乙醇发酵残渣于烘箱中60℃干燥，粉碎，过60 目筛。采用甲苯与乙醇（V∶V=2∶1）混合溶剂对粉碎的残渣进行索氏抽提6h，回收甲苯- 乙醇溶剂，将抽提后的残渣在60℃烘箱中烘干，得本实验所用的原料，备用。

1.2.2 杨木纤维乙醇发酵残渣中木质素含量的测定

采用72%硫酸法[15]测定杨木纤维乙醇发酵残渣中木质素含量，称量预处理样品1.0000g，移入100mL 烧杯中，加入约20℃的质量分数 72% 硫酸 15mL，充分搅拌之后，在20℃ 下放置4h，将其移入1000mL 的圆底烧瓶中，以 560mL 蒸馏水洗涤后移入烧瓶中，加上回流冷凝管，煮沸4h，生成的不溶性残渣用已恒重的玻璃漏斗抽滤，以热水洗净，105℃下干燥至恒重，称量，计算产率，平行测 3 次，取平均值即为克拉森木质素的质量分数。

将1.0000g 预处理样品放在坩埚中，于560℃的马弗炉中灼烧至恒重，计算灰分的质量分数，平行测 3 次，再按下式计算木质素的总质量分数。

样品中木质素质量分数= 克拉森木质素的质量分数－样品总灰分质量分数

本研究残渣中木质素的质量分数为39.78%。

1.2.3 木质素的提取

称取5.0g 预处理的原料，加入一定浓度的NaOH 溶液，在某水浴温度下恒温浸泡提取一段时间，过滤，滤渣可以继续回收作为生产杨木纤维乙醇的原料，滤液用盐酸溶液调节pH 值至1.5，析出沉淀，在常温下静置隔夜，有明显分层，去除上层清液，离心分离，沉淀先用pH=2 的盐酸溶液洗涤离心，再用蒸馏水洗涤离心，沉淀于60℃烘箱中烘干，即得到酶解木质素。

1.2.4 木质素分离的单因素试验

分别以不同浓度的NaOH（10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L），料液比[原料质量(g)∶碱溶液体积(mL)，1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50]，反应温度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃），反应时间（1h、1.5h、2h、2.5h、3h）为单因素，考察各因素对酶解木质素得率的影响。

1.2.5 正交试验

在单因素试验的基础上，采用 L9(34)正交试验，进一步分析碱浓度、料液比、反应温度以及反应时间对木质素得率的影响，优化木质素提取工艺。

1.2.6 木质素表征

紫外光谱测定：取少量干燥的本实验所提取的酶解木质素样品，溶于乙醇中，并以乙醇为空白，用紫外分光光度计测其在200～400nm 内的吸收 光谱。

红外光谱测定：取少量干燥的本实验所提取的木质素样品，磨成粉末，再与溴化钾粉末混合均匀，压成薄片，利用红外光谱仪测定其红外光谱。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 NaOH 浓度对木质素提取得率的影响

在料液比1∶30、反应温度50℃、反应时间2h条件下，考察不同NaOH 浓度对酶解木质素提取率的影响，结果如图1 所示。

如图1 所示，当碱浓度小于40g/L 时，酶解木质素的得率随着碱浓度的增大而升高，当浓度为40g/L 时酶解木质素得率最大，继续增大碱浓度，得率反而下降，这说明，酶解木质素在一定碱浓度溶液中，有很好的溶解性，浓度为40g/L 时，酶解木质素提取效果达到最佳，继续增大碱浓度，可能对酶解木质素基盐在碱溶液中的溶解造成一定阻碍，所以当碱浓度大于40g/L 时，酶解木质素的得率呈略微下降的趋势，因此，选取合适的碱浓度水平30g/L、40g/L、50g/L 进行正交试验。

图1 碱浓度对木质素得率的影响

图2 料液比对木质素得率的影响

2.1.2 料液比对木质素提取得率的影响

在碱浓度40g/L、反应温度50℃、反应时间2h条件下，考察不同料液比对酶解木质素提取率的影响，结果如图2 所示。

如图2 所示，当料液比大于1∶30 时，酶解木质素的得率随着料液比的减小而增大，料液比为1∶30g/mL 时，得率达到最大，随着料液比的继续减小，酶解木质素的得率有所下降，适当的碱溶液体积对酶解木质素的提取有很好的促进作用，因此，选取合适的料液比水平 1∶20g/mL、1∶30g/mL、1∶40g/mL 进行正交试验。

2.1.3 反应温度对木质素提取得率的影响

在碱浓度40g/L、料液比1∶30、反应时间2h条件下，考察不同反应温度对酶解木质素提取率的影响，结果如图3 所示。

如图3 所示，当反应温度在30～60℃范围内时，酶解木质素的得率随着温度的升高而增大，当温度达到60℃，酶解木质素的得率最大，继续升高温度，酶解木质素的得率反而减小，这可能是反应温度在30～60℃范围内时，随着反应温度的升高，原料中的酶解木质素与其他物质分离，并形成了溶解性较好的木质素复合物，在酸性环境中还原出了酶解木质素，得到了较好的提取效果，反应温度大于60℃时，可能对木质素结构造成了一定影响，不能很好的溶解于碱溶液中，从而使得酶解木质素的得率减小，因此，选取合适的反应温度水平50℃、60℃、70℃进行正交试验。

图3 反应温度对木质素得率的影响

2.1.4 反应时间对木质素提取得率的影响

在碱浓度40g/L、料液比1∶30g/mL、反应温度60℃条件下，考察不同反应时间对酶解木质素提取率的影响，结果如图4 所示。

图4 反应时间对木质素得率的影响

如图4所示，当反应时间少于2h时，酶解木质素的得率随着反应时间的延长而增大，当反应时间达到2h 时，得率最大，继续延长反应时间对得率的影响不大，且有略微下降。可能是由于反应时间为2h 时，酶解木质素在碱溶液中的溶解已经达到饱和，延长反应时间有部分酶解木质素因为聚积而析出，导致得率略微下降，所以选取合适的反应时间水平1.5h、2h、2.5h 进行正交试验。

2.2 酶解木质素提取的正交试验结果

根据单因素试验的研究结果，将碱浓度、料液比、反应温度和反应时间作为考察因素，按照 L9(34)正交试验对酶解木质素提取工艺进行优化，结果见表1 和表2。

由表2 可知，各因素对酶解木质素得率的影响最大的是碱浓度，其次是反应温度、料液比，最后是反应时间。最佳的工艺条件组合是NaOH 浓度40g/L、反应温度60℃、料液比1∶30g/mL、反应时间2.5h。

表1 因素水平表

表2 正交试验方案设计结果

对正交试验所得最佳提取工艺进行验证实验，3 次平行重复实验得到酶解木质素的得率分别为37.5%、37.45%、37.08%。通过验证实验可知，在最佳工艺条件下，酶解木质素的平均得率为37.34%，优于表2 中任一试验。

2.3 紫外光谱分析

在200～400nm 范围内扫描，测得本实验所提取的酶解木质素紫外光谱如图5 所示，在230nm 附近有较强的吸收带，说明具有较大的不饱和度，在280nm 附近出现宽肩峰是苯环的特征吸收峰，表明所测样品为芳香族化合物，这与红松木质素、云杉木质素、棉秆木质素的紫外光谱图接近[15-17]。

图5 酶解木质素的紫外吸收光谱

2.4 红外光谱分析

本实验所提取酶解木质素的红外光谱图如图6所示。与光谱图对应的各吸收峰归属分析见表3[18-20]。由表3 分析可知，发酵残渣中的酶解木质素结构单元主要是紫丁香基，其中侧链还有各种功能基团，如羟基、甲基、羰基等，酶解木质素是一种具有一定化学活性的物质，能够对其进行化学改性，应用到各相关领域中。该红外光谱与油茶壳[21]木质素和酶解玉米秸秆木质素[22]的红外光谱基本一致。

3 结 论

图6 酶解木质素的红外光谱图

表3 酶解木质素的红外光谱吸收表

（1）本研究通过单因素试验和正交试验对一 般碱法提取发酵残渣中酶解木质素的提取工艺进行优化，确定了最佳的提取工艺为 NaOH 浓度 40g/L、料液比1∶30、反应温度60℃、反应时间2.5h。在最佳工艺条件下，酶解木质素得率达到37.34%，对正交试验进行极差分析可知，碱浓度对酶解木质素的提取影响显著，选择合适的碱浓度至关重要。

（2）提取得到的酶解木质素为紫黑色块状固体，研磨得到棕褐色粉末，不溶于水，通过紫外光谱和红外光谱分析，验证了酶解木质素的芳香族结构，以紫丁香基木质素为主，而且具有羟基、羰基、甲氧基等活性基团，为其进一步改性应用提供理论基础。

（3）采用一般碱法提取发酵残渣中的酶解木 质素，具有反应条件温和、操作简单、提取率较高等优点。提取的酶解木质素具有良好的化学活性，可以对其进行改性，得到高附加值的产品，应用到工农业各领域。由于发酵残渣中木质素的提取，残渣中木质纤维结构更为松散，纤维素酶更易与纤维素和半纤维素接触，可以对其进行再次酶解发酵制取生物乙醇。这些都能降低木质纤维乙醇的生产成本，提高经济效益，促进木质纤维转化生物乙醇工业的发展。

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