树莓黄酮提取工艺的响应面法和正交法比较

杨　静，王　茜，韩红娟，李兴嵩，张田莉，刘永平，*（.中北大学化工与环境学院，山西太原03005；2.北京农学院农业部都市农业（北方）重点实验室，北京02206）

工艺技术

树莓黄酮提取工艺的响应面法和正交法比较

杨静1，2，王茜1，韩红娟1，李兴嵩1，张田莉1，刘永平1，*
（1.中北大学化工与环境学院，山西太原030051；2.北京农学院农业部都市农业（北方）重点实验室，北京102206）

摘要：以树莓干果为研究材料，总黄酮提取率为评价指标。先分析了超声时间、浸提温度和乙醇浓度各单因素对树莓总黄酮提取率的影响，再通过响应面法和正交法比较最佳提取工艺和产率，结果显示，响应面法最佳工艺为超声时间42.30 min，浸提温度80℃，乙醇浓度51.83%（约52%），理论预测值3.83%，实际验证值3.88%，并且超声时间和乙醇浓度存在交互作用；SPSS正交法的最佳工艺为超声时间40 min，浸提温度70℃，乙醇浓度50%，实际验证值是3.78%。虽然2种方法得出相似的最佳工艺，但响应面法能提供更多更精确的信息，最终产率也略高，值得推广。

关键词：树莓，黄酮，响应面法，正交法

树莓（Rubus idaeus，raspberry）是蔷薇科悬钩子属植物，又名悬钩子、托盘、覆盆子等，为多年生落叶灌木。果实药食两用，富含有机酸、维生素和黄酮等多种营养成分，其中黄酮类物质有抗氧化、抗癌、抗血管增生、消炎的功效[1-2]。近年来，超声波辅助提取方法由于操作简单、提取时间短、得率高，且不依赖大型设备等优点，目前广泛运用于包括植物细胞、果实、叶片、峰胶等多种材料的黄酮和其它天然产物提取[2-5]，因此，本研究采用超声波辅助提取法对树莓干果总黄酮提取工艺进行研究。

响应面法采用多元二次回归方程拟合自变量（因素）与响应值（产率）之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，是解决多变量问题的又一种统计方法[5-6]。随着该方法推广，据该方法开发的软件Design-expert也不断更新，能提供更多信息。正交设计以拉丁方的正交性为依据，进行有选择的试验，在解决多变量问题上应用更久更广泛。目前可以借助SPSS软件简化计算，便于获得最优的因素组合和最佳试验结果[7-8]。本文想通过这2种试验设计方法获得最佳的树莓黄酮超声辅助提取工艺，同时探讨这2种方法在寻找最优提取条件上的优劣。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

树莓干果：购于太原仁和大药房，用万能粉碎机将其粉碎至300 μm～400 μm，存放于常温干燥处备用。芦丁（Rutin）：上海金穗生物科技有限公司；其它化学试剂均为分析纯。

UV-9600紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器公司；DZKW-D-1电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；JOYN-15AL超声仪：上海乔跃电子有限公司；RE-5203旋转蒸发仪：上海亚荣仪器厂；SHZ-D（III）循环水式真空泵：巩义予华仪器有限责任公司。

1.2试验方法

1.2.1芦丁标准曲线的绘制

准确移取0.1 mg/mL芦丁标准液，以上溶液0、1、2、3、4、5、6 mL于10 mL刻度试管中，各加60%乙醇至6 mL，加10%亚硝酸钠溶液0.3 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液0.3 mL摇匀，放置6 min，加8%氢氧化钠试液2 mL，最后用60%乙醇溶液定容10 mL，摇匀，放置15 min，以第1瓶为空白，在510 nm波长处测吸光度。

1.2.2总黄酮含量的测定方法

抽滤浓缩总黄酮提取液后，用60%乙醇定容到100 mL容量瓶中，按1.2.1所述方法测定其吸光度。根据公式计算黄酮提取率：

式中：n为稀释倍数；C为提取液中总黄酮浓度，mg/mL；V为提取液体积，L；m为树莓干果的重量，g。

1.2.3单因素试验

准确称取树莓干果粉末5 g，置于200 mL玻璃培养瓶中，加入60%乙醇溶液50 mL，封口。以360 W功率超声波辅助提取30 min后，70℃恒温浸提1 h，减压抽滤，浓缩后用60%乙醇定容到100 mL。吸取0.3 mL于10 mL刻度试管中，按照1.2.1方法测定吸光度。由吸光度根据回归方程计算黄酮浓度，再计算树莓样品中黄酮的提取率。

在考察单因素试验时，仅改变超声时间（10、20、30、40、50、60 min）、浸提温度（50、60、70、80、90℃）或乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%），其它步骤如上不变。

1.2.4响应面法试验

根据单因素试验结果，采用Box-Behnken中心组合设计以A（超声时间）、B（提取温度）、C（乙醇浓度）为自变量，以黄酮提取率（%）为响应值的三因素三水平响应面分析试验。数据使用Design-Expert 8.0.5.1软件进行分析。

1.2.5正交法试验

根据单因素试验结果，选择正交法设计试验：以A（超声时间）、B（提取温度）、C（乙醇浓度）设计三因素三水平正交试验，数据使用SPSS20.0软件进行分析。

2　结果与分析

2.1标准芦丁曲线

标准芦丁曲线见图1。

图1　芦丁标准曲线Fig.1　Rutin standard curve

从图1中可以看出，该芦丁标准曲线是以芦丁浓度作为X轴，吸光度作为Y轴，回归方程为Y= 13.244X+0.0011，回归系数R2=0.999 6的直线。

2.2单因素试验结果与分析

在所选范围内各单因素对总黄酮提取率的影响如图2。

分别选择各个因素中包含最高提取率的3个水平，即超声时间为30、40、50 min，浸提温度为60、70、80℃，乙醇浓度为40%、50%、60%，进行下一步试验。

2.3响应面法试验设计和结果分析

2.3.1树莓干果黄酮的提取工艺

响应面试验方案和试验结果见表1。每组试验最少重复2次。

2.3.2黄酮提取率回归模型的建立及显著性检验

采用DesignExpert软件对试验数据进行多元回归拟合，得到以黄酮提取率为目标函数的二次回归方程：Y=3.61+0.23A+0.007B+0.14C+0.013AB+0.20AC+ 0.048BC-0.48A2+0.17B2-0.63C2。对该模型进行回归分析结果见表2。

模型的F=30.28，P<0.01，表明该模型回归极显著；模型失拟项F=0.60，P＞0.05，即失拟项不显著；因变量与所考察各自变量之间的R2=0.975 0线性关系显著，模型调整确定系数R2Adj=0.942 8，说明该模型能解释94.28%响应值的变化，总体说明模型对试验拟合情况较好，试验误差小，可用于预测树莓总黄酮提取最佳工艺。

图2　各提取参数对黄酮提取率的影响Fig.2　Effects of extraction parameters on the extraction rate of flavonoids

表1　响应面数据方案与试验结果Table 1　Design and results of Response Surface Methodology

表2　回归模型的方差分析Table 2　Analysis of variance（ANOVA）for the regression equation

从方差分析结果（表2）还可知：A，C，AC，A2，B2，C2的P<0.05差异显著性，各因素的F值大小依次是FA> FC>FB，说明超声时间和乙醇浓度对黄酮的提取率的影响效应显著，并存在交互作用，而浸提温度的影响相对较小，在所检测范围差异不显著，与其它2个因素之间也不存在交互作用，这也可以根据三维响应曲面印证，结果见图3。

图3　黄酮提取率的响应曲面图Fig.3　Response surface of the extraction rate of flavonoids

随着乙醇浓度和超声时间变化的响应面趋势呈抛物线，出现极大值，并且曲面坡度较陡，说明AC之间存在交互作用，见图3b；而曲面平缓，等高线稀疏，浸提温度边几乎保持直线，说明AB和BC之间交互作用不明显，即浸提温度与超声时间和乙醇浓度交互作用不大，见图3a、图3c。

据模型推测黄酮提取的最佳工艺条件理论值为：超声时间42.30min，浸提温度80℃，乙醇浓度51.83%，理论最高提取率3.83%。经过3次平行验证试验，实际测出的黄酮提取率3.88%，比模型预测略高1.31%，说明该方程与实际情况拟合很好，充分验证了所建模型的正确性。

2.4正交法试验设计和结果分析

根据单因素试验结果确定正交法试验设计和结果见表3，每个组合重复2次。

表3　正交设计和试验结果Table 3　Design and results of orthogonal design

据单因素统计分析可知各因素对黄酮提取率的影响强弱为：A2＞B2＞C2，即超声时间40 min，乙醇浓度50%，浸提温度70℃是提取树莓黄酮的最佳工艺，结果见表4。

表4　正交设计单因素统计Table 4　Single factor statistics of orthogonal design

经方差分析发现A-超声时间和C-乙醇浓度对试验结果有显著性影响，而浸提温度在所选择的60℃～80℃范围内对结果没有显著性影响见表5，与响应面法分析结果一致。正交法分析中R2=0.855和R2Adj= 0.776的值较响应面的小，说明在线性关系和数据拟合上不如响应面。

2.5响应面法与正交法比较

基于单因素分析，响应面法和正交设计都能进一步探究超声时间、浸提温度和乙醇浓度对树莓总黄酮提取率的影响，并获得最佳的提取工艺，但是各有优劣。

表5　正交设计的方差分析Table 5　Analysis of variance（ANOVA）for orthogonal design

2.5.1试验次数与数据信息

Design Expert软件设计响应面法设计三因素三水平试验17组见表1，其中X13-X17是5组重复的中心点（中心点可选1-999的任何数据[5]，软件默认5），以每个组合至少重复试验2次计算，试验最少进行29次。利用正交设计正交试验9组见表3，以每个组合至少重复试验2次计，试验最少进行18次，两种方法得出的最佳工艺结果基本相同见表6。

表6　最优工艺验证试验对比Table 6　Comparison of verification test results

方差分析结果都显示超声时间和乙醇浓度对提取率有显著影响，而在60℃～80℃区间内浸提温度的影响甚小，因此在响应面中最佳工艺中浸提温度80℃，而正交设计的最佳工艺中浸提温度是70℃都不影响结果。

但是响应面法对数据的分析比较详细，不仅可以知道各因素对提取率的影响的显著情况，还可以进一步分析出乙醇浓度和超声时间之间存在交互作用，见表2和图3b；而在现有的正交试验组数不能判断各因素之间是否存在交互作用，除非利用L18（37）设计试验组合，那么试验量将扩大一倍达到36次，超过响应面试验量，这也就丧失了目前基于L9（34）正交设计在试验次数较少的优势。实际上如果在不设重复的情况下响应面法分析软件可用17组数据分析（或最少13组），而正交法则只能利用极差法粗略分析，通过排列比较各组数据间极差值的大小，判断各因素不同水平之间对结果的影响大小选择最佳工艺，不能判断各因素的显著水平，也无法计算误差值[4]；如果用方差分析，则只能通过设置空白列或从A、B、C中选择均方最小列（没有显著差异），设为误差列进行计算，这样显然很粗略[7]。另外，即使在四因素、五因素或者更多因素的研究中，两种方法的试验量和数据信息也是同理所推。

2.5.2三维模拟和理论预测

响应面法借助软件可以三维模拟推测出更直观更精确的最佳工艺，并给出预测值，而正交法只能在已经出现过的因素水平值之间选择，也无法对结果进行预测。比较两种方法得出的最佳方案的验证试验，结果显示响应面的实际结果见表6，比预测值高出1.31%，比正交法验证结果高出2.65%。

3　结论

综上所述：响应面法和正交设计都能对树莓黄酮的超声提取工艺进行回归分析和参数优化，但是响应面法在少量增加试验次数的情况下，能提供更多精确的数据信息，更有利于在生产实践中寻找最佳工艺，节约成本，还可以模拟预测最高得率，值得推广。树莓黄酮最佳提取工艺为：超声时间42.30 min，乙醇浓度51.83%（约52%），浸提温度可控制在80℃。超声时间和乙醇浓度对结果有显著影响，并且存在交互作用。

参考文献：

[1]杨婷婷.树莓的研究现状及开发利用[J].四川林业科技,2013, 34(3):29-33

[2]高玉李,辛秀兰.树莓功能性成分及提取方法的研究进展[J].食品工业科技,2011,32(7):451-454

[3]张卫红,吴晓霞,马空军.超声波技术强化提取天然产物的研究进展[J].现代化工,2013,33(7):26-29

[4]李宁豫,韩秋菊,曹月坤.超声辅助提取山楂黄酮的研究[J].陕西农业科学,2013,59(3):91-93

[5]Liu Wei,Yu Yanying,Yang Ruzhen,et al.Optimization of total flavonoid compound extraction from Gynura medica leaf using response surface methodology and chemical composition analysis[J]. Internationaljournalofmolecularsciences,2010,11(11):4750-4763

[6]Box Gep,Behnken Dw.Some new three level designs for the study of quantitative variables[J].Technometrics,1960,2(4):455-475

[7]许良,席海山,藏洪禹,等.荞麦籽壳中芦丁的微波辅助提取工艺的SPSS正交设计优化[J].计算机与应用化学,2012,29(6):719-722

[8]张崟,王卫,张佳敏,等.响应面法和正交试验对骨素酶解工艺优化的比较[J].食品研究与开发,2012,33(7):53-56

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.026

收稿日期：2014-09-09

基金项目：国家自然科学青年基金（No.31200462）；山西省自然科学青年基金（No.2012021029-1）；大学生创新创业课题（No.2013-2014）资助

作者简介：杨静（1977—），女（白），副教授，博士，研究方向：植物生理生化。

*通信作者

Comparison of the Optimized Total Flavonoids Extraction Process from Raspberry by Response Surface Methodology and Orthogonal Design

YANG Jing1，2，WANG Qian1，HAN Hong-juan1，LI Xing-song1，ZHANG Tian-li1，LIU Yong-ping1，*
（1.School of Chemical Engineering and Environment，North University of China，Taiyuan 030051，Shanxi，China；2.Key Laboratory of Urban Agriculture（North）of Ministry of Agriculture P.R.China，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China）

Abstract：Dry raspberry fruits were used as experimental materials with the total flavonoids extraction rate as a measure indicator.Three extraction parameters including ultrasound time，extraction temperature and ethanol concentration were optimized by response surface methodology（RSM）and orthogonal design based on single factor investigations for achieving the maximum extraction rate of the total flavonoids.The results showed that the theoretical value of RSM was 3.83%under the optimum condition of ultrasound time 42.30 min，extraction temperature 80℃and ethanol concentration 51.83%（about 52%），and the actual extracting rate of the total flavonoids was 3.88%.There was the interaction between ultrasound time and ethanol concentration.Moreover，the actual extraction rate of orthogonal design under the optimum condition of ultrasound time 40 min，extraction temperature 70℃and ethanol concentration 50%was 3.78%.Although the optimum extraction conditions from two methods were the similarity，the RSM provided the more actual data information and got the higher extraction rate，which was worth of being generalized.

Key words：raspberry；flavonoids；response surface methodology；orthogonal design