利用大豆糖蜜制备细菌纤维素

吕鸿皓，黄　莉，党苗苗，费　楠，曹　亮，吴　磊，夏秀芳，*（.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨50030；.黑龙江省科学技术情报研究所，黑龙江哈尔滨50030）

利用大豆糖蜜制备细菌纤维素

吕鸿皓1，黄莉1，党苗苗1，费楠1，曹亮1，吴磊2，夏秀芳1，*
（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；2.黑龙江省科学技术情报研究所，黑龙江哈尔滨150030）

摘要：选用大豆糖蜜为发酵基质，利用木醋杆菌发酵制备细菌纤维素。研究糖蜜浓度、酵母浸粉添加量、发酵时间、发酵温度、接种量以及初始pH对细菌纤维素合成量、持水性和复水率的影响，结果表明：大豆糖蜜营养丰富，在大豆糖蜜浓度为15%时，在其中添加1.5%酵母浸粉、接种量为6%、初始pH4.5、30℃恒温静止发酵6 d后细菌纤维素合成量为1.17 g/100 mL，持水性为98.16%，复水率为292%，并利用傅里叶红外分析表明产物为细菌纤维素。

关键词：大豆糖蜜；细菌纤维素；持水性；复水率

大豆糖蜜为生产大豆浓缩蛋白过程中形成的醇溶性产品，因颜色和流动性类似于蜂蜜，所以命名为糖蜜。因为糖蜜不易处理，所以多数被废弃，不仅造成了环境的污染，而且也造成了能源的浪费[1]。以大豆糖蜜为发酵剂生产细菌纤维素不仅提高了糖蜜经济价值，促进了经济的发展，同时解决了大豆糖蜜对环境造成的污染。目前对大豆糖蜜的研究主要集中于功能性物质的提取和生物发酵剂的利用。国内主要利用大豆糖蜜提取大豆低聚糖、大豆异黄酮等功能性物质，如许浮萍[2]在其专利中采用醇沉法从大豆糖蜜中去除大豆低聚糖，再用离心法精制大豆异黄酮，产品纯度达到90%以上。因为大豆糖蜜成分复杂，含有微生物生长所需要的营养和水溶性矿物质元素，因此是优异的微生物发酵剂，同时大豆糖蜜价格低廉，从而降低了生产成本，因此大豆糖蜜作为微生物发酵剂的应用前景广阔[3]。如Qureshin[4]以大豆糖蜜为原料，用Clostridium beijerinckiiBA101菌种发酵生产丁醇，开辟了生产丁醇的新途径；Solaiman[5]采用Candida bombicola为菌种，以大豆糖蜜和油酸作为发酵原料生产槐糖脂。

细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）是由Brown首次报道的，他发现木醋杆菌在静止培养时在培养基表面会形成一层白色透明的膜，经分析鉴定此类物质为纤维素[6]。细菌纤维素与植物纤维素化学性质相同，但细菌纤维素却有许多独特的性质：高纯度、高弹性模量以及良好的生物适应性和生物可降解性[7]。因此，细菌纤维素成为当今研究的热点。

本试验以大豆糖蜜为微生物发酵的基础原料，利用木醋杆菌生产细菌纤维素，研究发酵条件对纤维素合成量、持水性、复水率的影响。

1　材料与方法

1.1材料与菌种

大豆糖蜜：山东古谷神生物科技集团有限公司提供；酵母浸粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖：天津市天力试剂有限公司；氯化钠：天津市光伏科技发展有限公司；氢氧化钠：天津市光复科技发展有限公司。

木醋杆菌（Acetobacter Xylinum）：购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心；斜面培养基：葡萄糖4.0%、酵母浸粉1.5%、琼脂1.5%、pH5.5，121℃高压灭菌15 min；种子培养基：葡萄糖4.0%、酵母浸粉1.5%、pH5.5，121℃高压灭菌15 min；斜面菌种的活化：从冰箱中将冷冻保存的木醋杆菌接种到新的斜面固体培养基上，在30℃恒温培养箱中培养24 h后，斜面上会长出新的菌落；种子培养：用接种环挑取一环活化好的斜面菌苔接种于装有100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，30℃静止培养24 h。

1.2仪器与设备

SHENAN灭菌锅：天津市科器高新技术公司；DH3600电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；ZHJH-1109无菌操作台：淳美科技有限公司；pHS-25型pH计：上海精科雷磁仪器厂；AL-104型精密电子天平：上海梅特勒-托利多仪器设备有限公司；PG-108手持糖度计：杭州陆恒生物科技有限公司；PerKin Elmer Spectrum 100傅里叶红外：美国铂金埃尔默公司。

1.3方法

1.3.1大豆糖蜜的预处理

处理方法：4 500 r/min离心15 min，取上清备用。

1.3.2大豆糖蜜成分的测定

总糖的测定利用手持糖量计测定；蛋白质的测定利用双缩脲法测定；水分的测定利用恒温干燥法测定。

1.3.3细菌纤维素合成量

参照崔思颖[8]纤维素干质量的测定方法，并作适当的修改，用蒸馏水冲洗细菌纤维素以除去膜表面培养基及杂质，用1%的NaOH溶液80℃水浴30 min，并持续用NaOH溶液浸泡至纤维素膜呈透明白色，采用醋酸中和至pH为中性，再用蒸馏水冲洗，60℃烘干至恒重并进行称量。

1.3.4持水性的测定

参照毋锐琴[9]的方法，具体如下：常温测定纤维素的持水性，平行称取三个样品，记为湿重W1，在60℃烘箱中干燥至恒重为干重W2，计算细菌纤维素膜的持水性：

1.3.4复水率的测定

将干燥好的膜放入蒸馏水中静止24 h，取出称纤维素膜的重量为W3，计算纤维素的复水率：

1.3.5细菌纤维素组分分析

使用傅里叶红外光谱仪进行红外光谱测试。采用溴化钾压片法分析细菌纤维素的红外光谱。干燥的溴化钾粉末与细菌纤维素粉末的用量比约为80∶1，在玛瑙研钵中研细均匀后放入专用压片器中以2 kg的压力加压制成透明的薄片。然后将此薄片放入仪器光束中进行测定（量程400 cm-1～4 000 cm-1）。

2　结果与分析

2.1大豆糖蜜成分测定结果

大豆糖蜜成分测定结果见表1。

表1　大豆糖蜜主要成分组成Table 1　Main ingredients of soy molasses

2.2糖蜜浓度的影响

在培养温度25℃，发酵时间5 d，pH5.5，接种量为4%，酵母浸粉添加量1.0%的条件下，考察大豆糖蜜含量为5%、10%、15%、20%、25%对细菌纤维素合成量、持水性和复水率的影响，结果如图1所示。

由图1可以看出，随着大豆糖蜜浓度的增加，细菌纤维的合成量、持水性和复水率呈现先增加后减少的趋势，且当糖蜜浓度为15%时均达到最大值，细菌纤维素的合成量为0.18 g/100 mL，细菌纤维素的持水性和复水率分别为97.72%和419%。说明大豆糖蜜营养成分丰富，能够作为木醋杆菌的发酵基质，并且所得的细菌纤维素具有较好的持水性和复水率。

图1　糖蜜浓度对纤维素合成量、持水性和复水率的影响Fig.1　Effect of soy molasses concentration on production，water holding capacity，rehydration of bacterial cellulose

2.3酵母浸粉添加量的影响

在培养温度25℃，发酵时间5 d，初始pH5.5，接种量为4%的条件下，在培养基中添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2%的酵母浸粉进行培养试验，考察不同添加量的酵母浸粉对细菌纤维素合成量、持水性和复水率的影响，结果如图2所示。

图2　酵母浸粉添加量对细菌纤维素合成量、持水性和复水率的影响Fig.2　Effect of the amount of yeast extract on production，water holding capacity，rehydration of bacterial cellulose

由图2可以看出，随着酵母浸粉添加量的增加，细菌纤维素的合成量、持水性和复水率表现为先升高后降低的趋势，且当酵母浸粉的添加量为1.5%时菌达到最大值，细菌纤维素的合成量为0.23 g/100 mL，细菌纤维素的持水性和复水率分别为97.72%和363%；与崔思颖[8]的研究基本一致，其研究酵母浸粉添加量为1.4%时，细菌纤维素的产量达到最大。

2.4初始pH的影响

在酵母浸粉添加量1.5%，糖蜜浓度15%，培养温度25℃，培养时间5 d，接种量4%的条件下，pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0对细菌纤维素合成量、持水性和复水率的影响，结果如图3所示。

由图3可以看出，随着pH的增加，细菌纤维素的合成量、持水性和复水率呈现先增加后减少的趋势，当pH4.5时，细菌纤维素的合成量为0.34 g/100 mL，细菌纤维素的持水性和复水率分别为98.14%和293%，且量均为最高，赵克勤[10]等研究利用大豆酶解液制备细菌纤维素的最适pH范围为3.5～4.0，其初始pH较低可能是因为木醋杆菌在发酵过程中会产生醋酸，较适应于酸性条件。

2.5培养时间的影响

在培养温度25℃，酵母浸粉添加量1.5%，糖蜜浓度15%，pH4.5，接种量为4%的条件下，考察4、5、6、7、8 d对细菌纤维素合成量、持水性和复水率的影响，结果如图4所示。

图3　初始pH对细菌纤维素合成量、持水性和复水率的影响Fig.3　Effect of the initial pH on production，water holding capacity，rehydration of bacterial cellulose

图4　发酵时间对细菌纤维素合成量、持水性和复水率的影响Fig.4　Effect of fermention time on production，water holding capacity，rehydration of bacterial cellulose

由图4可知，随着发酵时间的进行，前6 d细菌纤维素合成量、持水性和复水率上升较快，在发酵6 d时，细菌纤维素的合成量为0.42 g/100 mL，持水性和复水率分别为97.89%和314%，随着发酵时间的延长，细菌纤维素的合成量、持水性和复水率增长缓慢，所以确定发酵周期为6 d。汤卫华[11]等利用木葡糖酸醋杆菌的突变株研究合成细菌纤维素的最佳发酵时间同样为6 d。

2.6接种量的影响

在酵母浸粉添加量1.5%，糖蜜浓度15%，培养温度25℃，pH4.5、培养时间6 d的条件下，考察接种量为2%、4%、6%、8%、10%对细菌纤维素合成量、持水性和复水率的影响，结果如图5所示。

图5　接种量对细菌纤维素合成量、持水性和复水率的影响Fig.5　Effect of inoculum size on production，water holdingcapacity，rehydration of bacterial cellulose

从图5可知，接种量2%～6%时，随着接种量的增加，细菌纤维素的合成量、持水性和复水率显著增加，接种量6%时，细菌纤维素的合成量为1.13 g/100 mL，细菌纤维素的持水性和复水率分别为97.38%和318%，当接种量超过6%时，纤维素的合成量、持水性和复水率降低。与赵克勤[12]利用谷氨酸提取液生产细菌纤维素使用3%～4%的接种量较为接近。

2.7发酵温度的影响

取一环活化好的斜面种子接入液体培养基，25℃静止培养24 h，作为种子培养基。以6%的接种量，酵母浸粉添加量1.5%，糖蜜浓度15%，在20、25、30、35、37℃温度条件下恒温静止培养6 d，结果如图6所示。

图6　发酵温度对细菌纤维素合成量、持水性和复水率的影响Fig.6　Effect of fermention temperature on production，waterholding capacity，rehydration of bacterial cellulose

由图6可知，发酵温度20℃～37℃时，随着温度的不断升高，细菌纤维素的合成量、持水性和复水率先增加后减少，在温度为30℃时，细菌纤维的合成量、持水性和复水率达到最大值，细菌纤维素的合成量为1.17 g/100 mL，细菌纤维素的持水性和复水率分别为98.16%和292%，当温度高于30℃时，细菌纤维素的合成量、持水性和复水率下降；黄丹[13]等研究木醋杆菌QAX993发酵合成细菌纤维素的最适温度同样为30℃。

2.8细菌纤维素组分分析

利用傅里叶红外光谱分析细菌纤维素的组分，结果如图7所示。

图7　BC膜的红外光谱图Fig.7　FT-IR spectrum of BC

在纤维素的红外光谱中，重要表征纤维素的原子团包括有-CH2、-CH、-OH等，在3 430 cm-1处有较强的吸收峰为-OH键的伸缩振动，2 998 cm-1处为CH2和CH3基团的伸缩振动峰），在1 637 cm-1处为水中-OH的伸缩振动，在1 497 cm-1为-CH2对称伸缩振动峰，在1 385 cm-1为-CH伸缩振动峰，在670 cm-1和618 cm-1为OH不对称弯曲。由以上可知，红外光谱上可能出现的有机化合物基团有-CH2、-CH、-OH等，这些基团与纤维素的分子结构式中所包含的有机化合物基团基本吻合。与沈金朋[14]等利用酒糟浸出液制备的细菌纤维素的红外光谱图基本一致。

3　结论

大豆糖蜜营养丰富，适合做木醋杆菌发酵的基本培养基，同时所得的细菌纤维素具有较好的持水性和复水率，即大豆糖蜜浓度为15%时，酵母浸粉添加量为1.5%、接种量为6%、初始pH4.5、30℃恒温静止发酵6 d后细菌纤维素合成量为1.17 g/100 mL，持水性为98.16%，复水率为292%。

参考文献：

[1]高玉荣,刘洋,李大鹏,等.大豆糖蜜高产单细胞蛋白菌株的筛选及其生长条件[J].中国酿造,2010,33(8):1-2

[2]许浮萍,白志明,王哲.制备大豆异黄酮、大豆皂苷、低聚糖和大豆浓缩蛋白的方法.中国:专利号ZL200510011328.4.[P].2005-10-19

[3]王校红,田娟娟,王丹.大豆糖蜜的综合利用[J].粮油食品科技, 2010,1(18):23-24

[4]Qureshin N,Lolas A,Blaschek Hp.Soy molasses as fermentation substrate for production of butanol using Clostridium beijerinckii-BA101[J].J Ind Microbiol Biot,2001,26(5):290-295

[5]Solaiman D K,Ashby R D,Zerkowshi J A,et al.Simplified soy molasses-based medium for reduced-cost production of sophorolipids by Candida bombicola[J].Biotechnology Letters,2007,29(9):1341-1347

[6]马霞,土瑞明,贾士儒.细菌纤维素在食品工业中的应用[J].食品研究与研发,2002,23(5):11-12

[7]胡海霞,张宝善,姜烛.细菌纤维素发酵生产及其改性研究进展[J].食品工业科技,2008,29(10):267-268

[8]崔思颖,朱明军,邓毛程．不同培养方式制备的细菌纤维素性质的比较[J]．造纸科学与技术,2012(1):67-70

[9]毋锐琴.高产细菌纤维素菌株的筛选及发酵工艺优化[D].西北农林科技大学硕士学位论文,2008:28-29

[10]赵克勤,谭平,刘国平.利用大豆生产细菌纤维素的研究[J].安徽农业科学,2009,37(8):3409-3411

[11]汤卫华,李飞,贾原媛.细菌纤维素高产菌株的诱变选育和发酵条件的研究[J].2009,25(9):1018-1019

[12]赵克勤,谭平,鲁伦文,等.利用谷氨酸提取液生产细菌纤维素的研究[J].食品与机械,2003,23(2):53-54

[13]黄丹,王清路,王云飞.木醋杆菌QAX993发酵生产细菌纤维素条件的探讨[J].中国发酵,2008,12:36-37

[14]沈金朋,罗庆平,段晓惠,等.利用酒糟浸出液制备细菌纤维素[J].食品科学,2010,3(31):203-206

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.044

收稿日期：2014-09-01

基金项目：国家科技支撑计划课题（2015BAD16B00）

作者简介：吕鸿皓（1989—），男（汉），硕士，研究方向：水产品加工及贮藏。

*通信作者：夏秀芳（1973—），女，副教授，博士，研究方向：农产品加工及贮藏。

Fermentation of Soybean Molasses for Bacterial Cellulose Preparation

LÜ Hong-hao1，HUANG Li1，DANG Miao-miao1，FEI Nan1，CAO Liang1，WU Lei2，XIA Xiu-fang1，*
（1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China；2.Institute of Scientific and Technical Information of Heilongjiang，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

Abstract：Bacterial cellulose（BC）was prepared from soybean molasses fermented by Acetobacter xylinum. The research explored parts of fermentation conditions on bacterial cellulose production，water holding capacity and rehydration rate as well，such as the soy molasses concentration，the amount of yeast extract，fermentation time，fermentation temperature，inoculum size and the initial pH.Results showed that the soybean molasses was rich in nutrients.The yield of BC was 1.17 g/100 mL when 15%soy molasses with the addition of 1.5%yeast extract was conducted to static fermentation at pH 4.5，6%inoculum size and 30℃for 6 days.Water holding capacity of bacterial cellulose was 98.16%，bacterial cellulose rehydration was 292%.The product was bacterial cellulose by Fourier transform infrared analysis.

Key words：soy molasses；bacterial cellulose；water holding capacity；rehydration rate